新たなリン酸化プロテオミクスによるMAPキナーゼ経路の標的因子の網羅的解析

利用新的磷酸蛋白质组学综合分析 MAP 激酶通路的靶因子

• 批准号: 18770166
• 负责人: 小迫 英尊
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: The University of Tokushima (2007)The University of Tokyo (2006)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770166/
• 关键词: MAPキナーゼ; プロテオミクス; リン酸化; 2D-DIGE; 抗リン酸化抗体; アクチン架橋タンパク質; EPLIN; 細胞運動; リン酸化モチーフ抗体; 細胞質ダイニン; 核膜孔複合体; ヌクレオポリン

本研究では、多様な細胞内シグナル伝達系で重要な役割を果たすERK/MAPキナーゼをモデル系とし、細胞内キナーゼ基質を網羅的に同定するための新たなリン酸化プロテオーム解析法を開発して、得られた新規基質のリン酸化制御を解明することを目標としている。昨年度までに、IMACによる全細胞抽出液からのリン酸化タンパク質の濃縮法、蛍光標識二次元ディファレンスゲル電気泳動(2D-DIGE)技術、及びERKのリン酸化モチーフを認識するモノクローナル抗体などを組み合わせることにより、新規ERK基質の候補を24種類同定することができた。二次元イムノブロットやバイオインフォマティクスによる解析結果を考慮して14種類を選択し、GST融合タンパク質を調製したところ、13種類はERKによりin vitroでリン酸化されることが判明した。この中で一番強くリン酸化されたEPLIN(epithelial protein lost in neoplasm)はアクチン架橋タンパク質の一つであり、多くのヒト癌細胞で発現レベルが低下していることが知られていた。さらなる解析の結果、i)ERKはEPLINの3ヶ所のセリン残基をin vitro及びin vivoでリン酸化し、ii)ERKによるリン酸化はEPLINのC末端側でのアクチン結合能を低下させ、iii)静止期にストレスファイバーに局在するEPLINはERKによるリン酸化に伴ってラッフル膜へ移行し、iv)ERKリン酸化部位のアラニン変異体を発現させると野生型EPLINの発現に比べてPDGF刺激によるストレスファイバーの消失、ラッフル膜の形成、細胞運動性の上昇が抑制される、等が明らかとなった。従ってERKはEPLINをリン酸化することによってアクチン骨格系と細胞運動を制御すると考えられた。

This study aims to develop and clarify a new method for the analysis of ERK/MAP in a variety of intracellular systems, including the identification of ERK/MAP in intracellular systems, and the identification of ERK/MAP in intracellular systems. In the past year, IMAC has developed a whole cell extract extraction method, a fluorescence identification two-dimensional electrophoresis (2D-DIGE) technique, and a new ERK matrix candidate for 24 species identification. The analysis results of the two dimensional matrix are considered. 14 kinds of matrix are selected. 13 kinds of matrix are determined. EPLIN(epithelial protein lost in neoplasm) is a strong acid in the medium, and many cancer cells appear in the medium. The results of analysis: i)ERK was acidified in vitro and in vivo at three residues of EPLIN; ii)ERK was acidified in vitro and in vivo at three residues of EPLIN; iii) ERK was acidified in vitro and in vivo at three residues of EPLIN; iii) ERK was acidified in vivo at three residues of EPLIN; iv)ERK protein activation site changes were observed during PDGF stimulation, such as the disappearance of ERK protein, inhibition of ERK membrane formation, and increase of cell motility. EPLIN is the key to controlling cell movement.

项目成果

Global analysis of dynamic changes in lipid raft proteins during T-cell activation

• DOI: 10.1002/elps.200600675
• 发表时间: 2007-06-01
• 期刊: ELECTROPHORESIS
• 影响因子: 2.9
• 作者: Kobayashi, Michimoto;Katagiri, Takuya;Hattori, Seisuke
• 通讯作者: Hattori, Seisuke

新たなリン酸化プロテオミクスによる細胞内キナーゼ基質の網羅的同定:ERK/MAPキナーゼによるアクチン架橋タンパク質EPLINのリン酸イヒを介した細胞運動制御

使用新的磷酸化蛋白质组学全面鉴定细胞内激酶底物：通过 ERK/MAP 激酶磷酸化肌动蛋白交联蛋白 EPLIN 来控制细胞运动

• 发表时间: 2007
• 作者: M.Kobayashi;T.Katagiri;H.Kosako et al.;小迫 英尊 他
• 通讯作者: 小迫 英尊 他

タンパク質のリン酸化(タンパク質の事典)(猪飼篤、伏見譲 編)

蛋白质磷酸化（蛋白质百科全书）（由Atsushi Ikai和Yuzuru Fushimi编辑）

• 发表时间: 2007
• 作者: 小迫英尊;後藤由希子
• 通讯作者: 後藤由希子

Purification of phosphoproteins by immobilized metal affinity chromatography and its application to phosphoproteome analysis

• DOI: 10.1111/j.1742-4658.2007.05705.x
• 发表时间: 2007-03-01
• 期刊: FEBS JOURNAL
• 影响因子: 5.4
• 作者: Machida, Mitsuyo;Kosako, Hidetaka;Hattori, Seisuke
• 通讯作者: Hattori, Seisuke

Nephl, a component of the kidney slit diaphragm, is tyrosine phosphorylated by the Src family tyrosine kinase and modulates intracellular signaling by binding to Grb2.

Nephl 是肾裂隙隔膜的组成部分，被 Src 家族酪氨酸激酶酪氨酸磷酸化，并通过与 Grb2 结合来调节细胞内信号传导。

• 发表时间: 2008
• 期刊: J. Biol. Chem. 283
• 作者: 中野;賢太郎・高稲;正勝;Y. Harita
• 通讯作者: Y. Harita