リン酸化プロテオームによるインスリン/Akt経路の標的因子の網羅的解析法の開発

利用磷酸蛋白质组开发胰岛素/Akt通路靶因子综合分析方法

• 批准号: 16012211
• 负责人: 小迫 英尊
• 金额: $ 3.14万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16012211/
• 关键词: IMAC; 2D-DIGE; 網羅的解析; Akt; インスリン; リン酸化; 質量分析計; 二次元電気泳動

本研究では、特定のシグナル伝達経路に関与するリン酸化タンパク質を効率的・網羅的に同定するための、汎用性の高いプロテオーム解析法の開発を目標としている。本年度はそのモデル系として、インスリンやPDGFなどの細胞外因子によって活性化するPI3キナーゼ/Akt経路のリン酸化プロテオーム解析を開始した。まずガリウムイオンを用いた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC : immobilized metal ion affinity chromatography)による全細胞タンパク質からのリン酸化タンパク質の濃縮・精製法を開発した。さらに比較する試料を異なる蛍光色素で標識して同一ゲル中で二次元電気泳動する方法(2D-DIGE法:two-dimensional difference gel electrophoresis)とIMACを組み合わせることにより、従来プロテオーム解析による検出が困難とされてきた、微量なシグナル伝達因子のリン酸化による変動を高感度かつ定量的に検出することに成功した。そこでヒトインスリン受容体を過剰発現しているCHO-IR細胞を用いて、インスリン刺激によって増大し、かつwortmanninやLY294002などのPI3キナーゼ阻害剤で前処理するとインスリンによる増大が抑制されるスポットを検索した。またNIH3T3細胞を用いて、PDGF刺激によって同様の検索を行った。血清飢餓培養の条件、阻害剤の種類・濃度・処理時間、刺激の濃度・時間、さらに抽出液の調製法など、種々の条件検討を詳細に行った結果、2D-DIGE解析ゲルイメージにおいて目的とする変動スポットを数十個得ることができた。これらの変動スポットの一部はAktのリン酸化コンセンサスを認識する抗体と反応したため、Akt基質であると考えられた。現在質量分析計によるタンパク質同定を進めている。

The purpose of this study is to develop a method for analyzing the relationship between the specific type and the quality of the network. This year, we started to analyze the extracellular factors of PDGF and the activation of PI3/Akt pathway. Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) was developed for the concentration and purification of whole cell protein. The method of two-dimensional difference gel electrophoresis (2D-DIGE method) and IMAC is used to compare the different samples and to identify the two dimensional difference gel electrophoresis in the same sample. CHO-IR cells are stimulated by the presence of a receptor in the medium, increased by wortmannin and LY294002, and inhibited by the presence of a receptor in the medium. The same observations were made using NIH 3T3 cells and PDGF stimulation. Serum starvation culture conditions, inhibitor type, concentration, treatment time, stimulation concentration, time, preparation method of extract solution, seed condition, detailed analysis results, 2D-DIGE analysis, target, change, dozens of results. A part of the reaction is to react to the reaction. Now the quality analysis program is in progress.

项目成果

2D DIGE技術を用いたリン酸化プロテオーム解析によるシグナル伝達経路構成因子の網羅的同定法

利用2D DIGE技术进行磷酸化蛋白质组分析的信号转导通路成分综合鉴定方法

• 发表时间: 2004
• 期刊: 実験医学 22(9)
• 作者: 小迫英尊;牛山正人;服部成介
• 通讯作者: 服部成介

Proteomic identification of Bcl2-associated athanogene 2 as a novel MAPK-activated protein kinase 2 substrate

Bcl2 相关的 athanogene 2 作为新型 MAPK 激活蛋白激酶 2 底物的蛋白质组学鉴定

• 发表时间: 2004
• 期刊: J Biol Chem. 279(40)
• 作者: Ueda K;Kosako H;et al.
• 通讯作者: et al.