リン酸化プロテオームによるインスリン/Akt経路の標的因子の網羅的解析法の開発

利用磷酸蛋白质组开发胰岛素/Akt通路靶因子综合分析方法

基本信息

批准号：
16012211
负责人：
小迫英尊
金额：
$ 3.14万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
起止时间：
2004 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16012211/
关键词：
IMAC 2D-DIGE 網羅的解析 Akt インスリンリン酸化質量分析計二次元電気泳動

项目摘要

本研究では、特定のシグナル伝達経路に関与するリン酸化タンパク質を効率的・網羅的に同定するための、汎用性の高いプロテオーム解析法の開発を目標としている。本年度はそのモデル系として、インスリンやPDGFなどの細胞外因子によって活性化するPI3キナーゼ/Akt経路のリン酸化プロテオーム解析を開始した。まずガリウムイオンを用いた固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー(IMAC : immobilized metal ion affinity chromatography)による全細胞タンパク質からのリン酸化タンパク質の濃縮・精製法を開発した。さらに比較する試料を異なる蛍光色素で標識して同一ゲル中で二次元電気泳動する方法(2D-DIGE法:two-dimensional difference gel electrophoresis)とIMACを組み合わせることにより、従来プロテオーム解析による検出が困難とされてきた、微量なシグナル伝達因子のリン酸化による変動を高感度かつ定量的に検出することに成功した。そこでヒトインスリン受容体を過剰発現しているCHO-IR細胞を用いて、インスリン刺激によって増大し、かつwortmanninやLY294002などのPI3キナーゼ阻害剤で前処理するとインスリンによる増大が抑制されるスポットを検索した。またNIH3T3細胞を用いて、PDGF刺激によって同様の検索を行った。血清飢餓培養の条件、阻害剤の種類・濃度・処理時間、刺激の濃度・時間、さらに抽出液の調製法など、種々の条件検討を詳細に行った結果、2D-DIGE解析ゲルイメージにおいて目的とする変動スポットを数十個得ることができた。これらの変動スポットの一部はAktのリン酸化コンセンサスを認識する抗体と反応したため、Akt基質であると考えられた。現在質量分析計によるタンパク質同定を進めている。

这项研究旨在开发一种高度通用的蛋白质组学分析方法，以有效且全面地鉴定参与特定信号途径的磷酸化蛋白。今年，我们开始对PI3激酶/AKT途径的磷蛋白组分析，该途径被胰岛素和PDGF等细胞外因子激活，作为模型系统。首先，我们开发了一种通过使用镀耐酸离子固定的金属离子亲和力色谱法（IMAC）从全细胞蛋白中富集和纯化磷酸化蛋白的方法。此外，通过将iMac与二维差异凝胶电泳（2D-DIGE方法）和二维差异凝胶电泳结合在一起，我们在同一凝胶中成功地高度敏感并定量地检测了少量信号因子磷酸化引起的变化，这些信号因子先前难以通过蛋白质分析来检测。因此，我们搜索了通过过表达人类胰岛素受体的CHO-IR细胞增加胰岛素刺激的斑点，并且当用PI3激酶抑制剂（如WORTMANNNIN和LY294002）预处理时，胰岛素诱导的升高被抑制。还通过PDGF刺激使用NIH3T3细胞进行了类似的搜索。在广泛检查了各种疾病之后，包括血清饥饿培养的条件，类型，浓度，抑制剂的治疗时间，浓度和刺激时间以及提取物的制备方法，我们能够在2D-DIGE分析凝胶图像中获得数十个靶向变量斑点。这些波动点中的一些被认为是AKT底物，因为它们与识别Akt磷酸化共识的抗体反应。当前，正在使用质谱仪进行蛋白质识别。