肝発癌におけるCCNDBP1とDNA損傷チェックポイント機構の関連性の解明

昨年度は、マウス肝細胞由来のcell lineであるAML12に対して、RNPをトランスフェクトすることでchk1とchk2を相同組換え修復(Puromycin耐性遺伝子を挿入)を利用してノックアウトし、Puromycinによるセレクションの後に解析することを試みたが、遺伝子改変効率が低く解析に難渋したため、当初の目標であった遺伝子改変細胞を免疫不全マウスに移植することは断念する方針とした。一方で、昨年度実績報告書作成に並行して、sgRNAの設計の見直し、トランスフェクション試薬や暴露時間の変更、SCR7添加、Puromycinの濃度設定などの実験条件の再検討を行っていたところ、遺伝子改変効率を改善することに成功した。その結果、コントロールとしてalbをターゲットとした場合には、Puromycin耐性コロニーを容易に確認することが可能となった。同コロニー由来の細胞からmRNAを抽出し、qPCRを行うとalbの転写が有意に低下していることも確認可能であった。ところが、chk1をターゲットとした場合は極端に生存細胞が少なく、Puromycin耐性コロニーの形成は認めなかった。同様にin vivo実験として、マウス肝に対してAAV8ベクターを用いてchk1ターゲットのsgRNAならびにcas9のcDNAを導入した場合にも、回収した肝サンプル内にKO後の細胞を検出することができなかった。十分な量の遺伝子改変細胞を採取することが不可能であったため、詳細な解析には至っていないが、ここまでの結果からはマウス肝細胞においてｃｈｋ1が細胞生存に必須の因子である可能性が示唆された。現在、chk1をターゲットとしたヒト肝癌由来のcell lineでの検証、ならびにchk2をターゲットとした検証を継続中である。

昨年度は、マウス肝細胞由来のcell lineであるAML12に対して、RNPをトランスフェクトすることでchk1とchk2を相同組換え修復(Puromycin耐性遺伝子を挿入)を利用してノックアウトし、Puromycinによるセレクションの後に解析することを試みたが、遺伝子改変効率が低く解析に難渋したため、当初の目標であった遺伝子改変細胞を免疫不全マウスに移植することは断念する方針とした。一方で、昨年度実績報告書作成に並行して、sgRNAの設計の見直し、トランスフェクション試薬や暴露時間の変更、SCR7添加、Puromycinの濃度設定などの実験条件の再検討を行っていたところ、遺伝子改変効率を改善することに成功した。その結果、コントロールとしてalbをターゲットとした場合には、Puromycin耐性コロニーを容易に確認することが可能となった。同コロニー由来の細胞からmRNAを抽出し、qPCRを行うとalbの転写が有意に低下していることも確認可能であった。ところが、chk1をターゲットとした場合は極端に生存細胞が少なく、Puromycin耐性コロニーの形成は認めなかった。同様にin vivo実験として、マウス肝に対してAAV8ベクターを用いてchk1ターゲットのsgRNAならびにcas9のcDNAを導入した場合にも、回収した肝サンプル内にKO後の細胞を検出することができなかった。十分な量の遺伝子改変細胞を採取することが不可能であったため、詳細な解析には至っていないが、ここまでの結果からはマウス肝細胞においてｃｈｋ1が細胞生存に必須の因子である可能性が示唆された。現在、chk1をターゲットとしたヒト肝癌由来のcell lineでの検証、ならびにchk2をターゲットとした検証を継続中である。