Investigation of molecular insight into genome editing tools by single-molecule imaging

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本研究は、ゲノム編集ツールである様々なCasタンパク質酵素に高速原子間力顕微鏡（以下、高速AFM）を適用し、Casタンパク質がDNAを切断する瞬間を１分子イメージングすることで、その分子作動メカニズムを統一的に理解することを目的とする。2017年に我々は、Casタンパク質の中で最も研究の進んでいるSpCas9に高速AFMを適用し、SpCas9が標的DNAを探索・結合・切断する一連の過程を１分子動画撮影することに成功した。この研究成果を基盤とし、様々な種に存在する多様なCasタンパク質、および、その巨大複合体に対し高速AFMを適用し、DNA切断ドメインの揺らぎ・構造変化・物性を網羅的に解析する。2年目は、黄色ブドウ球菌に由来する小型のSaCas９を用い、sgRNAやDNAのデザイン、および、SaCas9が機能できる高速AFM基板条件と観察バッファー条件の最適化を行った。その結果、SaCas9が標的DNAに結合し、切断する瞬間を捉えることに成功し、論文発表を行った。特に、RNA結合状態において，開いた構造と閉じた構造を遷移する様子や，SaCas9がDNA切断後すぐにDNAから離れる様子をリアルタイムで可視化することに成功した。これまでの研究成果と合わせて，本研究成果はCas9のDNA切断分子作動メカニズムの深い理解につながり，ゲノム編集技術のさらなる高度化を目指した基盤研究となることが期待される。次年度は、さらに別の種(Francisella novicida)由来のCas9やRNA切断酵素Cas13aに対して高速AFM観察を試み、Casタンパク質の核酸切断機構における統一的な分子作動機構の解明を目指す。