Mass identification and modification of pyrophosphate-dependent kinases based on their three-dimensional structures

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kinase によるリン酸化反応は、代謝や環境変化への応答など種々の重要な生命活動に関わる。リン酸化反応は ATP をリン酸基供与体とする報告がほとんどであるが、私達はピロリン酸 (PPi) をリン酸基供与体とするリン酸化反応の機構を世界に先駆けて明らかにし、PPi 依存性の kinase (PPi-kinase) を ATP 依存性 kinase (ATP-kinase) と見分けうる指標を見いだした。本研究ではこの指標を手がかりに、データベースに眠る未同定の PPi-kinase を様々な生物から同定することをめざしている。また、遺伝子データベース中の kinase から PPi-kinase を効率的に見いだす方法の構築も目指している。2021 年度に実施予定であった研究は、新型コロナウイルスの蔓延による所属機関の活動制限により、2022 年度にかけて 2 年間にわたっておこなった。まず、タンパク質三次元構造データベース (PDB) に登録されている kinase の約 2500 個について、予備研究により見出している立体構造上の特徴を有するかを調査した。この結果、いくつかの酵素を PPi-kinase の候補とすることができた。並行して予備研究で PPi-kinase であることが判明している酵素について、大腸菌による大量発現と精製、結晶化とならびに X 線結晶構造解析を行い、PPi-kinase がどのように PPi を認識するのかの解析をすすめた。活性スクリーニングについては、分担研究者の愛媛大学高橋准教授により、無細胞系での酵素発現、タグに対応する抗体と磁気ビーズによる精製により、多検体を効率的に発現精製す系を構築した。この系で発現精製した酵素により、PPi-kinase の候補が実際に PPi-kinase 活性を持つことも確認できた。