生体膜での脂肪酸ナノスケール解析技術確立による不飽和脂肪酸生理機能発現機序の解明

建立生物膜脂肪酸纳米级分析技术阐明不饱和脂肪酸的生理功能表达机制

• 批准号: 19K22435
• 负责人: 藤田 秋一
• 金额: $ 4.16万
• 依托单位: Kagoshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Challenging Research (Exploratory)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-06-28 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19K22435/
• 关键词: 脂肪酸; 微細局在; ナノスケール; 電子顕微鏡; 急速凍結; フリーズフラクチャー; 微細構造; 生体膜; 脂質; 微細分布; 超微細構造; 凍結割断レプリカ法

申請者らは脂質の超微局在を明らかにすることが、膜脂質の機能を解明するために必須であると考え、そのための方法開発に注力してきた。その結果、急速凍結・凍結割断レプリカ標識法（QF-FRL: Quick Freezing & Freeze-fracture Labeling）によって膜脂質を特異的に標識することが可能であることを示し、生体膜脂質の二次元的分布をナノレベルで定量的に解明することに成功した。このQF-FRL法が識別するのは糖鎖、イノシトール環など、膜脂質の“親水性頭部”の違いであるのに対し、膜脂質の多様性のもう一つの要因である“疎水性尾部”の違いを明らかにすることは原理的に困難であった。本研究では、現在用いているQF-FRL法をさらに改良することにより、凍結レプリカ脂肪酸標識法を新たに改良し、生体膜における脂肪酸分布をナノレベルで解析することを可能にする。哺乳類培養細胞あるいは培養組織の培養液中にアルキン化不飽和脂肪酸を入れ細胞内に取り込ませ、そのアナログが本来の内在性脂質と同様の性質を持つことを確認し、そしてクリックケミストリー法により不飽和脂肪酸を標識することができた。標識方法を確立するために、まず蛍光標識法で行い光学顕微鏡を用いて解析し、最適な条件を確定した。具体的には、市販されているアルキン化オレイン酸（１価不飽和脂肪酸）を用いて培養細胞において蛍光標識することに成功した。アルキン化オレイン酸を哺乳類培養細胞に取り込ませた後、アルデヒドで固定しbiotin-azideと反応させることにより、蛍光標識を得ることができた。ラット膵臓の培養組織における不飽和脂肪酸の標識には、培養細胞と同様の方法を用い、外来性に投与した不飽和脂肪酸の蛍光標識の条件検討を行い、不飽和脂肪酸の標識ができる条件を見出すことができた。

Applicants ら は lipid の superfine bureau in を Ming ら か に す る こ と が, membrane lipid の functional を interpret す る た め に must で あ る と え test, そ の た め の way open 発 に note force し て き た. Youdaoplaceholder0 そ result, rapid freeze · freeze cut レプリカ identification method (QF-FRL:) Quick Freezing & Freeze - fracture Labeling) に よ っ て membrane lipid を specific に logo す る こ と が may で あ る こ と を し, living body distribution of membrane lipid の secondary yuan を ナ ノ レ ベ ル で quantitative に interpret す る こ と に successful し た. こ の QF - FRL が identification す る の は sugar lock, イ ノ シ ト ー ル ring な ど, membrane lipid の の violations い "hydrophilic head" で あ る の に し seaborne, membrane lipid の multiple others の も う a つ の by で あ る の violations い "疎 water-based tail" を Ming ら か に す る こ と は principle に difficult で あ っ た. This study で は, now use い て い る QF - FRL method を さ ら に improved す る こ と に よ り and freeze レ プ リ カ fatty acids identification method を new た に improved し, living body membrane に お け る fatty acid distribution を ナ ノ レ ベ ル で parsing す る こ と を may に す る. Mammals culture cell あ る い は training organization の medium, に ア ル キ ン the unsaturated fatty acid を に take into れ cell り 込 ま せ, そ の ア ナ ロ グ が originally の internality with others in lipid と の nature を hold つ こ と を confirm し, そ し て ク リ ッ ク ケ ミ ス ト リ ー method に よ り unsaturated fatty acid を logo す る こ と が で き た. Identification method を establish す る た め に, ま ず 蛍 light line identification method で い optical 顕 micromirror を with い て analytical し, optimum conditions on な を し た. Specific に は, city vendor さ れ て い る ア ル キ ン change オ レ イ ン acid (1 価 unsaturated fatty acid) を い て culture cell に お い て 蛍 light logo す る こ と に successful し た. ア ル キ ン change オ レ イ ン acid を mammals culture cell に take り 込 ま せ た, ア ル デ ヒ ド で fixed し biotin - azide と anti 応 さ せ る こ と に よ り, 蛍 light logo を る こ と が で き た. ラ ッ ト Cui viscera の training organization に お け る unsaturated fatty acid の logo に と は, cultivating cells with others の way を い, foreign に cast and し た unsaturated fatty acid の 蛍 light line identification 検 の conditions for を い, unsaturated fatty acid の logo が で き を る conditions show the す こ と が で き た.

项目成果

ヒトmalaria原虫Plasmodium falciparumの細胞膜ではラフト主成分の糖脂質GM3は内葉と外葉の両方に局在する

在人类疟疾寄生虫恶性疟原虫的细胞膜中，作为筏的主要成分的糖脂GM3位于内部和外部小叶中。

• 发表时间: 2021
• 作者: 向達汐美;正谷達謄;小西里可子;黒川夕奈;山口優希;富奥甘奈;福田佳代子;Hakimi Hassan;麻田正仁;金子修;藤田秋一
• 通讯作者: 藤田秋一

鹿児島大学共同獣医学部分子細胞生物学藤田秋一研究室

鹿儿岛大学兽医联合学院分子细胞生物学系藤田明一实验室

Phosphatidylinositol 4‐phosphate on Rab7‐positive autophagosomes revealed by the freeze‐fracture replica labeling

通过冷冻断裂复制标记揭示 Rab7 阳性自噬体上的磷脂酰肌醇 4-磷酸

• DOI: 10.1111/tra.12623
• 发表时间: 2018
• 期刊: Traffic
• 影响因子: 4.5
• 作者: Kurokawa Yuna;Yoshida Akane;Fujii Emi;Tomioku Kanna;Hayashi Hiroki;Tanabe Kenji;Fujita Akikazu
• 通讯作者: Fujita Akikazu

酵母細胞でのautophagosome膜およびautophagic body膜における膜脂質の微細分布解析

酵母细胞自噬体和自噬体膜膜脂精细分布分析

• 发表时间: 2021
• 作者: 山口優希;黒川夕奈;向達汐美;福田佳代子;正谷達謄;藤田秋一
• 通讯作者: 藤田秋一

酵母および哺乳類細胞におけるホスファチジルイノシトール４キナーゼの役割

磷脂酰肌醇 4-激酶在酵母和哺乳动物细胞中的作用

• 发表时间: 2019
• 作者: 黒川夕奈;小西理可子;富奥甘奈;藤田秋一
• 通讯作者: 藤田秋一