Development of non-viral vector to realize treatment of hereditary disease using genome editing RNA technology

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本研究では、申請者らのオリジナルの非ウイルスベクターであるポリアミドアミン (PAMAM) デンドリマー/シクロデキストリン結合体（CDE）に肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に対するリガンドを結合体したGN-PaCを用いたゲノム編集に基づく難治性遺伝子疾患治療に関する検討を実施している。本研究の特徴は、細胞における外来遺伝子の発現に大きなバリアとなっている細胞核膜を突破が不要なCRISPR mRNAとガイドRNAとGN-PaCとの３元複合体を用いて、肝臓の難治性疾患であるトランスサイレチン（TTR）型家族性アミロイドポリニューロパチー（TTR-FAP）に対するゲノム編集に基づく根治治療を目的としている。2022年度は次のような検討を行った。レポーター遺伝子として、Cap1構造を有するルシフェラーゼmRNAはCap0構造を有するmRNAに比べて遺伝子発現効率が高いことが示された。ジェネレーション (G) が異なるPAMAMデンドリマーとmRNAとの複合体形成を電気泳動により確認した結果、G2はN/P比1.0以上で、G3とG4はN/P比0.5以上で完全に複合体を形成し、GN-PaC(G3)もmRNAと完全に複合体を形成した。N/P比100で形成したPAMAMデンドリマー(G3)/mRNA複合体は、正のゼータ電位を示し、粒子径は約1000 nmであった。一方、GN-PaC(G3)複合体はPAMAMデンドリマー(G3)複合体と同様なゼータ電位を示すとともに、サブミクロンのサイズの微粒子を形成した。N/P比100で形成したPAMAMデンドリマー(G3)/mRNA複合体は、PAMAMデンドリマー(G2)複合体及びPAMAMデンドリマー(G4)複合体よりもHepG2細胞及びHeLa細胞において、高い遺伝子発現を示した。さらに、GN-PaC(G3)/mRNA複合体は、希釈溶媒としてOpti-MEMを用いることにより、PAMAMデンドリマー(G3)/mRNA複合体よりも高い遺伝子発現を示した。研究業績に関しては論文発表及び学会発表を行った。