权益分类	功能权益	普通用户	{{item.name}}会员
{{category.name}}	{{benefitItem.name}}

Development of gene replacement method and its application to generation of useful organic acids producer in citric acid-hyperproducing filamentous fungus

基因替换方法的建立及其在高产柠檬酸丝状真菌中产生有用有机酸生产剂中的应用

基本信息

批准号：
20J12091
负责人：
吉岡育哲
金额：
$ 1.09万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2020
资助国家：
日本
起止时间：
2020-04-24 至 2022-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、クエン酸高生産糸状菌（カビ）である Aspergillus tubingensis WU-2223L を宿主としてゲノム編集を駆使し、クエン酸生産機構の解明および生産機構の適切な改変（利用）による有用有機酸生産菌の育種を目的としている。本年度では、前年度に明らかにしたクエン酸高生産に主たる寄与をするミトコンドリアのクエン酸輸送体遺伝子cocAを標的として「クエン酸生産の抑制」と「アコニット酸生産の促進」を指向した代謝工学的育種を実施した。「アコニット酸生産の促進」としてA. terreusの有するcis-アコニット酸輸送体遺伝子を遺伝子置換法によりcocA遺伝子座に挿入（置換）すると、クエン酸生産量は親株と比較して約60%減少し、親株には認められない「アコニット酸の菌体外への蓄積」が確認された。すなわち、ミトコンドリア輸送系の置換によりアコニット酸の蓄積の促進とクエン酸生産の抑制に成功した。一方、排出されたアコニット酸の生産量は1 g/L未満とクエン酸のそれ（60 g/L）と比較して低収量であった。そこでクエン酸（アコニット酸の前駆体）のさらなる菌体内への蓄積による収量増加を狙い、既知のクエン酸輸送体遺伝子cexAをノックアウトしたところクエン酸の生産量は90%以上激減したが、trans-アコニット酸の生成量も約50%減少した。また対照的に、cexAの高発現によりクエン酸およびtrans-アコニット酸の収量が増大することも見出し、すなわちクエン酸排出タンパクCEXAにはtrans-アコニット酸の排出活性があるという世界初の知見を得た。以上より、本年度ではクエン酸生産菌を宿主にミトコンドリアの改変を通じた「クエン酸生産の抑制」および「有用有機酸生産へ代謝の転換（＝生産の促進）」が可能であることを、trans-アコニット酸生産菌の育種を実例に示すことができた。

The purpose of this study was to identify Aspergillus tubingensis WU-2223L as a host for the production of useful organic acids. This year, the main purpose of high acid production is to promote the development of metabolic engineering. "Promotion of Acid Production" A. Terreus has been identified as having a 60% decrease in acid production compared to parent plants by the method of substitution of coca-based acid transporter genes. The replacement of the transport system for the production of organic acids and the promotion of their accumulation were successful. 1 g/L of acid was produced and the amount of acid discharged was 60 g/L. The production of trans-3-carboxylic acid increased by more than 90% and the production of trans-3-carboxylic acid decreased by about 50%. CexA is the first discovery in the world that the activity of CexA in the removal of trans-6-carboxylic acid increases with the increase in the amount of trans-6-carboxylic acid. This year, we have been able to demonstrate the possibility of improving the host environment of acid producing bacteria by inhibiting acid production and improving the metabolism of useful organic acids production.