NMRとX線によるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

利用 NMR 和 X 射线分析黑曲霉酸性蛋白酶 A 的折叠机制

• 批准号: 09261205
• 负责人: 田之倉 優
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09261205/
• 关键词: 酸性プロテアーゼA; NMR; X線結晶構造解析

クロコウジカビAspergillus niger var.macrosporusが分泌する酸性プロテアーゼAは基質特異性、阻害剤に対する反応性、一次構造、分子量等の性状が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる新規の酸性プロテアーゼである。本研究では、プロテアーゼAの立体構造、変性中間状態ならびに中性変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにすることを目指してX線結晶構造解析とX線小角散乱測定を行った。本酵素が活性を示すpH1.5〜3で得られた結晶についてX線回折を測定したところ、1.4Åの分解能の反射が得られた。重原子誘導体の探索を行った結果、Hgおよび2種類のPtの同型置換体が得られた。電子密度図から、この分子はクロワッサン型をしており、αヘリックスを含まずβシートのみからなることが分かった。アスパラギン酸プロテアーゼも主としてβシートからなるクロワッサン型をしており、プロテアーゼAは分子量がアスパラギン酸プロテアーゼに比べて約半分であるにもかかわらず、分子の外形はアスパラギン酸プロテアーゼと大雑把には相似形といえる。ただ、βシート構造の分子全体に対する配向が両者で明らかに異なっており、プロテアーゼAの立体構造は新規の3次元構造だった。また、酸性から弱アルカリ性の種々のpHでX線小角散乱の測定を行った。その結果、GuinierプロットからpHが高くなるに従って慣性半径Rgが増大することが示された。またKratkyプロットから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded structureであること、(2)pH6.2では完全なfolded stateでもunfolded stateでもない中間的な状態であること、が分かった。pH4.5からpH8.0への遷移速度をX線小角散乱測定したところ、時定数0.5秒の遷移が見られた。

クロコウジカビAspergillus niger var.macrosporus が secretion す る acidic プロテアーゼA は matrix specificity, blocking agent に対 する reactivity, Characteristics such as the primary structure and molecular weight, the original acidic enzyme and the new standard of the different enzymes. This study analyzes the three-dimensional structure of the A's three-dimensional structure and the intermediate state of the neutral and changing process of the neutral and changing properties.ーゼAのfolding mechanism を明らかにすることを Eye refers to してX-ray crystal structure analysis and X-ray small angle scatter measurement を行った. The activity of this enzyme is shown in the pH range of 1.5 to 3, the crystallization of the enzyme is measured by X-ray reflection, and the decomposition energy of 1.4Å is reflected by the reflection. The results of the search for heavy atom inducers, and the results of the search for heavy atom inducers, and the isotype substitution of Hg and Pt are two types. Electron densityまずβシートのみからなることが分かった.アスパラギン acid プロテアーゼも主としてβシートからなるクロワッサン type をしており, プロテアーゼAは molecular weight がアスパラギンAcid プロテアーゼに than べて is about half a minute, であるにもかかわらず, outside of the molecule The shape of the はアスパラギン acid プロテアーゼと大鑑恫は is similar to the shape of といえる.ただ、βシートstructure のmolecules all に対するalignment が両人で明らかにdifferentなっており、プロテアーゼA's three-dimensional structure は Shingui's 3-dimensional structure だった.また、Acidic からWeak アルカリ性のkind 々のpHでX-ray small angle scattered のdetermination を行った.そのRESULTS, GuinierプロットからpHが高くなるに従ってInertial radius Rgが嗗大することがshowされた.またKratkyプロットから、(1)pH4.5ではfolded structure、pH6.75や7.0ではunfolded structureであること、(2)pH6.2ではcompletely folded stateでもunfolded stateでもない中なstateであること、が分かった. pH 4.5 and pH 8.0 are used to measure the migration speed of X-ray small angle scattering, and the migration speed is measured in 0.5 seconds.

项目成果

Suzuki,Y.ラ: "Hydrolysis of AMPPNP by the motor domain of ncd,a kinesin-related protein." FEBS Lett.409・1. 29-32 (1997)

Suzuki, Y. La：“NCD 的运动结构域对 AMPPNP 的水解，一种驱动蛋白相关蛋白。” FEBS Lett.409·1 (1997)。

Sato,K.ラ: "Crystallization and preliminary crystallographic studies of dimethy1 sulfoxide reductase from Rhodobacter sphaeroides f.sp.Denitrificans." Proc.Japan Acad.73B・2. 30-32 (1997)

Sato, K. La：“来自球形红细菌 f.sp.Denitificans 的二甲基亚砜还原酶的结晶和初步晶体学研究”，Proc.Japan Acad.73B·2 (1997)。

Ichikawa,T.ラ: "Crystallization and preliminary crystallographic analysis of the sarcosine oxidase from Bacillus sp.NS-129." J.Struct.Biol.120. 109-111 (1997)

Ichikawa, T. La：“芽孢杆菌 NS-129 肌氨酸氧化酶的结晶和初步晶体学分析。J.Struct.Biol.120 (1997)。

Suzuki,Y.ラ: "Modulation of actin filament sliding by mutations of the SH2 cysteine in Dictyostelium myosin II." Biochem.Biophys.Res.Commun.234・3. 701-706 (1997)

Suzuki, Y. La：“网网柄菌肌球蛋白 II 中 SH2 半胱氨酸突变对肌动蛋白丝滑动的调节。Biochem.Biophys.Res.Commun.234·3 (1997)”