X線とNMRによるクロコウジカビ酸性プロテアーゼAの折れたたみ機構の解析

利用 X 射线和 NMR 分析黑曲霉酸性蛋白酶 A 的折叠机制

• 批准号: 10157201
• 负责人: 田之倉 優
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10157201/
• 关键词: 酸性プロテアーゼA; NMR; X線結晶構造解析

クロコウジカビAspergillus niger var.macrosporusが分泌する酸性プロテアーゼAは基質特異性、阻害剤に対する反応性、一次構造、分子量等の性状が、従来のペプシン型酵素とは著しく異なる新規の酸性プロテアーゼである。本研究では、プロテアーゼAの立体構造、変性中間状態ならびに中性変性過程の解析を行ない、プロテアーゼAの折れたたみ機構を明らかにすることを目指してX線結晶構造解析とX線小角散乱測定を行った。本酵素が活性を示すpH1.5〜3で得られた結晶についてのX線結晶構造解析の結果、この分子はクロワッサン型をしており、αヘリックスを含まず2枚の湾曲したβシートからなることが分かった。軽鎖はβシートを構成するβストランドとして両方のβシートに含まれている。本蛋白質のNMRスペクトルの指紋領域も、βシートに富む蛋白質に特徴を示した。X線小角散乱測定のI(O)(zero angle intensity)はpH6.5以上において約60%近くに減少し、このpHで既に重鎖と軽鎖が解離していることを示している。一方慣性半径R_gはpH6.3以下では20Åで一定であり、pH8.3の30ÅまでpHの上昇とともに徐々に増加した。散乱面積の積分強度は、pH-profileよりpH6.5においてはまだcompact性が残っていた。Kratkyプロットの結果も考慮すると、pH6.5において重鎖と軽鎖が解離しているが、重鎖はまだcompact性を残しており、さらにpHが上昇するにつれて徐々に広がって行くと考えられる。一方、ストップトフロー法によりpH4.5からpH8.3へpHジャンプを行い、X線溶液散乱測定により解析したところ、積分面積強度において非常に速い変化(k=0.55s^<-1>)が観測された。I開始、終了時点におけるR_gの値はstatic測定のものと一致した。

クロコウジカビAspergillus niger var.macrosporus が secretion す る acidic プロテアーゼA は matrix specificity, blocking agent に対 する reactivity, Characteristics such as the primary structure and molecular weight, the original acidic enzyme and the new standard of the different enzymes. This study analyzes the three-dimensional structure of the A's three-dimensional structure and the intermediate state of the neutral and changing process of the neutral and changing properties.ーゼAのfolding mechanism を明らかにすることを Eye refers to してX-ray crystal structure analysis and X-ray small angle scatter measurement を行った. The activity of this enzyme is shown in the pH range of 1.5 to 3. The results of the X-ray crystal structure analysis of the crystal structure and the molecular structure of this enzyme are obtained.クロワッサンをしており、αヘリックスを恾ず2 pieces of のwanquしたβシートからなることが分かった.軽 lockはβシートを constitutes するβストランドとして両方のβシートに contain まれている. The NMR fingerprint of this protein is in the field, and the β-type protein is in the specific area. X-ray small angle scatter measurement I(O)(zero angle Intensity) is about 60% lower than pH 6.5 or more, and the pH value is reduced by about 60%, and the pH value is re-locked and dissociated. One side of the inertial radius R_g means that pH 6.3 or less means a fixed value of 20Å, and a value of 30Å for pH 8.3 means a rising value of pH. Integrated intensity of scattered area, pH-profile of pH6.5, compactness of pH-profile. Kratky プロットのRESULTS すると、pH6.5において Heavy lock と軽 lock が dissociation しているが、 Heavy lock はまだcompact sex を residual しており, さらにpH がrise するにつれて Xu 々に広がって行くと卡えられる. One side, ストットフローmethod によりpH4.5からpH8.3へpHジャンプを行い, X-ray solution scattering measurement methodよりanalyticsしたところ, integrated area intensityにおいてvery fast change (k=0.55s^<-1>)が観measurementされた. I start and end time points are consistent.