Comprehensive approach toward understanding cell surface receptor functions coupled with membrane structure and lipid composition

了解细胞表面受体功能以及膜结构和脂质组成的综合方法

• 批准号: 19H05647
• 负责人: 佐甲 靖志
• 金额: $ 97.93万
• 依托单位: Institute of Physical and Chemical Research
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (S)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-06-26 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19H05647/
• 关键词: 受容体; １分子計測; 細胞内情報伝達; 細胞膜; 1分子計測

本研究は、最新の１分子計測法などにより、ヒトの主要な膜受容体 (GPCR, RTK) のほぼ全ての分子種について受容体と近傍脂質の自己組織化による機能制御機構を明らかにすることを目的とする。研究は下記４項目とそれらの統合的な解釈で構成される。本年度の研究概要は以下の通りである。１．膜受容体の細胞膜動態の網羅的な１分子計測:ヒトRTK58種中52種について蛍光蛋白質タグを結合してHEK293細胞に発現させ、リガンドあるいは対照刺激前後の１分子計測を終了した。リガンドが知られていないRTKに関しては対照としてHEK細胞が内在的に発現しているEGFRのリガンド(EGF)を用いた。隠れマルコフモデル解析により、各分子種共通に拡散速度の異なる3状態間の遷移モデルが適用できることが明らかになり、それぞれの分子種について数重の動態パラメータを決定した。今後はこの計測結果に基づく特徴づけを行う。２．膜脂質と受容体の超解像可視化:RTKの一種EGFRと周辺脂質PIP2, PSの超解像計測を行い、PIP2との共局在がEGF刺激前後で変化すること、さらにPIP2がEGFRの２量体形成とリン酸化を促進し、リン酸化したEGFRはPLCgammaへの情報伝達でPIP2を分解するという自己制御的な受容体周辺脂質の再編成機能を発見した。３．膜受容体の境界脂質の分析:EGFR周辺脂質の組成変化を生化学的に証明するため、EGFR分子近傍10 nmの細胞膜をSMAでnative nanodiscとして切り出し精製を進めている。薄層クロマトグラフィーと質量分析により予備的な計測を行い、精製法を最適化している。４．再構成膜における膜受容体の脂質制御の解析:EGFRの膜貫通-膜近傍領域を人工ペプチドとして作成し、再構成nanodisc中で１分子構造ダイナミクス計測を行った結果を論文発表した。

This study aims to clarify the functional control mechanism of the molecular species of GPCR (RTK) and the self-organization of nearby lipids by using the latest molecular assay. The research notes 4 items below: This year's research summary is as follows: 1. Molecular measurement of membrane dynamics of membrane receptors: 52 of 58 RTK species were detected in HEK293 cells, and molecular measurement was completed before and after irradiation. The EGF-related gene is used to detect EGFR in HEK cells. The EGF-related gene is used to detect EGFR in HEK cells. The molecular species have different diffusion rates and different migration rates. The molecular species have different diffusion rates and different migration rates. In the future, the measurement results will be based on characteristics. 2. Superresolution visualization of membrane lipids and receptors:RTK EGFR, peripheral lipids PIP2, PS and PIP2 were detected by superresolution measurement before and after EGF stimulation, and PIP2 and EGFR 2 volume formation and acidification were promoted, acidification of EGFR and PLCgamma information transmission and PIP2 decomposition were also detected. 3. Analysis of membrane receptor lipids: biochemical evidence of lipid composition change around EGFR, native nanodisc of SMA near 10 nm of EGFR molecule The preparation of thin layer chromatography for quality analysis and optimization of purification methods 4. Analysis of lipid control of membrane receptor in reconstituted membrane: artificial selection of EGFR in membrane-near-membrane domain, molecular structure of EGFR in reconstituted nanodisc

项目成果

Insulin signaling shapes fractal scaling of C. elegans behavior.

胰岛素信号塑造线虫行为的分形尺度。

• DOI: 10.1038/s41598-022-13022-6
• 发表时间: 2022-06-21
• 期刊: Scientific reports
• 影响因子: 4.6

Biphasic spatiotemporal regulation of GRB2 dynamics by p52SHC for transient RAS activation.

• DOI: 10.2142/biophysico.bppb-v18.001
• 发表时间: 2021
• 期刊: Biophysics and physicobiology
• 影响因子: 1.5
• 作者: Yoshizawa R;Umeki N;Yamamoto A;Murata M;Sako Y
• 通讯作者: Sako Y

Two Closed Conformations of CRAF Require the 14-3-3 Binding Motifs and Cysteine-Rich Domain to be Intact in Live Cells

CRAF 的两个闭合构象需要 14-3-3 结合基序和富含半胱氨酸的结构域在活细胞中保持完整

• DOI: 10.1016/j.jmb.2023.167989
• 发表时间: 2023
• 期刊: Journal of Molecular Biology
• 影响因子: 5.6
• 作者: Okamoto Kenji;Sako Yasushi
• 通讯作者: Sako Yasushi

佐甲細胞情報研究室

佐科细胞信息研究所

Ulsan University(韓国)

蔚山大学（韩国）