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セミ・インタクト細胞を利用した情報伝達分子システムの再構成と1分子反応解析

セミ・インタクト細胞を利用した情報伝達分子システムの再構成と1分子反応解析
利用半完整细胞重建信息传递分子系统和单分子反应分析
批准号：
16013229
负责人：
佐甲 靖志
金额：
$4.48万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2004
资助国家：
日本
项目状态：
已结题
起止时间：
2004 至 --
来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-16013229/
关键词：
StreptolysinOMap kinaseRac1分子計測MEKEGF細胞増殖

项目摘要

项目成果

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細胞増殖信号を処理する細胞内分子システムEGF-Ras-MAPKシステムは、細胞増殖信号を処理する細胞内分子システムである。このシステムの内、新規遺伝子発現に至るメインストリーム、すなわちEGFと受容体の結合から、低分子量G蛋白質Rasの活性化、MAPキナーゼカスケードの情報伝達をへてERKが核移行するまでを再構成することを目的とし研究を行った。複雑な細胞システムを精製分子から完全再構成することは不可能であるので、生細胞から要素を減らしていくこと(トップダウン法)によって再構成を行うことととし、抗生物質であるstreptolysin Oで細胞膜を透過性にしたヒト上皮由来のA431細胞(セミ・インタクト細胞)を調整した。セミ・インタクト化の最適条件を検討した結果、EGFおよびATPの添加によってセミ・インタクト細胞内に生細胞と同様にEGF受容体のリン酸化反応を起こすことが可能になった。受容体のリン酸化は、蛍光標識した抗活性型EGF受容体抗体確認した。次に、HeLa細胞より細胞質を調整し、大腸菌に別途発現・精製したMEK1(MAPKK),CFP-ERK2(MAPK)、およびATP,GTPを添加して、A431セミ・インタクト細胞内に導入したところ、CFPの蛍光は細胞核外のみに認められた。これは、静止細胞状態でERKがMEKと複合体を形成して細胞質に存在することに対応している。同様に調整したセミ・インタクト細胞にあらかじめEGFを与えた場合、核外の蛍光は減少し、核内に強い蛍光が集積した。これはEGF情報によるMEK1,CFP-ERK2のリン酸化により、CFP-ERK2が核内に移動したものと考えられる。以上のように、情報伝達システムのプロトタイプが完成した。
期刊论文(10)
专著(0)
科研奖励(0)
会议论文
Single-molecule measurement in living cells.
活细胞中的单分子测量。
DOI： --
发表时间： 2004
期刊： Trend.Anal.Chem. 23
影响因子： --
作者： [Ichinose, J, Sako, Y.]
通讯作者： Y.
Single molecule observation of amplification of EGF receptor activation in semi-intact A431 cells.
半完整 A431 细胞中 EGF 受体激活放大的单分子观察。
DOI： --
发表时间： 2004
期刊： Biochem.Biophys.Res.Comm. 324
影响因子： --
作者： [Ichinose, J., Murata, M., Yanagida, T., Sako, Y.]
通讯作者： Y.
細胞内情報処理システムを1分子計測する「<1分子>生物学 生命システムの新しい理解」(合原一幸、岡田康志編)
用一个分子测量细胞内信息处理系统的《<单分子>生物学：对生命系统的新认识》（相原和之、冈田康主编）
DOI： --
发表时间： 2004
期刊：
影响因子： --
作者： [森松美紀, 佐甲靖志, 佐甲靖志]
通讯作者： 佐甲靖志
1分子計測法による細胞内分子システムの解析
使用单分子测量方法分析细胞内分子系统
DOI： --
发表时间： 2004
期刊： BME 18
影响因子： --
作者： [森松美紀, 佐甲靖志]
通讯作者： 佐甲靖志
１分子動態に基づく細胞膜受容体の機能予測
Comprehensive approach toward understanding cell surface receptor functions coupled with membrane structure and lipid composition
膜構造・膜脂質ダイナミクスと共起する細胞膜受容体の情報伝達
細胞内情報伝達の再構成系における非線形反応の解析
海外基金