運動ストレス応答にカルパインの酵素活性はなぜ必要なのか？

为什么钙蛋白酶活性对于运动应激反应是必需的？

• 批准号: 19H04014
• 负责人: 尾嶋 孝一
• 金额: $ 11.15万
• 依托单位: National Agriculture and Food Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2019
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2019-04-01 至 2023-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19H04014/
• 关键词: 骨格筋; カルパイン; 運動刺激

本研究では骨格筋に発現するカルパインファミリーに着目し、どのようにして運動ストレスを感知し、どのような基質を切断し、切断した基質に対してどのような機能を付与することで運動ストレスから防御するのか、という点を解明することを目的とする。これまでに、培養細胞系における運動刺激モデルである培養骨格筋細胞に電気刺激を負荷する系において、カルパイン3の活性化をモニターし、負荷する電気刺激のパターン、強さ、負荷時間と、カルパイン３自己消化断片の出現パターンを評価した。本年度はカルパイン３以外にもカルパイン１および２が骨格筋細胞には発現しているため、運動刺激モデルにおいてこれらのカルパインが酵素学的に活性化するのか否かを精査した。その結果、カルパイン１の自己消化断片が微弱ながら検出できたこと、およびカルパインの代表的な基質であるスペクトリンの断片が運動刺激モデルを負荷した培養骨格筋細胞にて検出できたことから、カルパイン１も運動刺激モデルにおいて活性化していると示唆された。マウスに運動負荷をかける予備実験を行った結果、野生型マウスと比較して酵素活性不全のカルパイン３を野生型カルパイン３の代わりに発現するマウスのトレッドミルでの走行距離が短い傾向にあった。今後この結果の再現性をとるためにマウスの匹数を増やして行う。カルパイン3の基質となる筋原線維性タンパク質を見出したため、アミノ酸シークエンサーにより切断部位のアミノ酸残基の同定を試みた。サンプル量が十分に取れないせいか同定できなかった。今後、量が少なくとも可能な質量分析計において測定する。

这项研究的重点是在骨骼肌中表达的钙蛋白酶家族，旨在阐明如何检测到运动压力，裂解哪些底物以及对裂解的底物的何种功能，以防止运动压力。迄今为止，在一个系统中监测了钙蛋白酶3的激活，该系统在培养的骨骼肌细胞上加载电刺激的系统，这是培养的细胞系中运动刺激的模型，并评估了电刺激载荷，强度，加载时间和钙蛋白酶3自动消化片段的电气刺激模式。除了钙蛋白酶3之外，今年，钙蛋白酶1和2在骨骼肌细胞中表达，我们研究了这些钙蛋白酶在运动刺激模型中是否被酶激活。结果，钙蛋白酶1的自体碎片被弱检测到，并且可以在带有运动刺激模型的培养的骨骼肌细胞中检测到Spectrin（Calpain的代表性底物）的片段，这表明Calpain 1在运动刺激模型中也被激活。进行了初步的实验，将运动负荷施加到小鼠中，并与野生型小鼠相比，表达酶不活跃的钙蛋白酶3而不是野生型钙蛋白酶3的小鼠在跑步机上倾向于较短。将来，将增加小鼠的数量，以确保该结果的可重复性。由于肌原纤维蛋白是钙蛋白酶3的底物，因此我们尝试使用氨基酸序列鉴定裂解位点的氨基酸残基。由于样本数量不足，因此无法识别。将来，将使用至少能够使用的质谱仪来测量量。

项目成果

骨格筋萎縮 －タンパク質分解酵素 カルパイン の観点から－

骨骼肌萎缩——从蛋白水解酶钙蛋白酶的角度来看——

• 发表时间: 2019
• 作者: Osawa Seita;Kato Hisashi;Maeda Yuki;Takakura Hisashi;Ogasawara Junetsu;Izawa Tetsuya;尾嶋 孝一
• 通讯作者: 尾嶋 孝一

FRET-based probes capture muscle-specific calpain-3 (CAPN3) activity in myotubes.

基于 FRET 的探针捕获肌管中肌肉特异性钙蛋白酶 3 (CAPN3) 活性。

• 发表时间: 2019
• 作者: K. Ojima;S. Hata;F. Shinkai-Ouchi; M. Oe;S. Muroya;H. Sorimachi;Y. Ono.
• 通讯作者: Y. Ono.