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iPS細胞3次元網膜組織培養を用いた老化によるミトコンドリア障害の解析

使用 iPS 细胞 3D 视网膜组织培养分析衰老引起的线粒体疾病

基本信息

批准号：
18K09423
负责人：
尾里納美
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-04-01 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18K09423/
关键词：
iPS細胞ミトコンドリア網膜 DNA二本鎖切断老化

项目摘要

本研究では、タモキシフェン（TM）によってDNA二本鎖切断（DSB）を誘発可能なマウスiPS細胞から分化誘導した3次元網組織（網膜オルガノイド）にDSBを人為的に誘発し、網膜神経組織における老化とDSBの関連を分子レベルで解析することを目的としている。このマウスiPS細胞においてTMの添加でDSBを誘発する条件を探索した。DSBが誘発された細胞の確認は、抗GFP・HA抗体による蛍光染色像とDNAを抽出しq-PCRで確認した。マウスiPS細胞では、TMの添加によってDSBが誘発されたが、その割合は非常に低かった。マウスiPS細胞を三次元網膜誘導条件で培養し、凸型に細胞が配列する層状構造のオルガノイドを分化誘導した。形成された細胞層が視細胞であるか、オルガノイドで切片を作成し抗ロドプシン抗体による蛍光染色で確かめた。オルガノイドは分化誘導開始から、層状構造になるにつれて平滑な表面（凸面がつるりとしている）になる。しかし、その平滑さは25日を過ぎる頃から崩れ始めた。分化初~中期でTMを添加したオルガノイドでは分化が途中で停止した。後期での添加は、平滑な表面の崩れ始めるのを早める傾向があった。オルガノイドの切片では、抗ロドプシン抗体で標識される細胞数や、Tom20などで標識したミトコンドリアの分布などにTM処理の有無における顕著な差は見られなかった。しかしながら、TM処理したオルガノイドでも、抗GFP・HA抗体で標識されなかったので、実際、オルガノイドのどの細胞で全体の何割でDSBが誘発されたのか染色像から判断することはできなかった。今後は、TM処理の有無によるオルガノイド間での解析だけでなく、一つのオルガノイド内でDSBが誘発された細胞とされなかった細胞を区別し解析をすることで、組織老化だけでなく、個々の細胞老化による組織全体への影響も解析できる方法の確立が必要である。

In this study, we investigated the possibility of inducing DNA double lock cleavage (DSB) in human retinal neurons (TM), and the molecular analysis of the relationship between DSB and aging in retinal neurons. The conditions for the development of DSB in iPS cells were explored. DSB was identified by PCR and DNA was extracted from anti-GFP/HA antibody. iPS cells, TM cells and DSB cells are very low. Under three-dimensional induction conditions, iPS cells were cultured and differentiated into lamellar structures. The cells that form the layers of the cells are stained with light and anti-inflammatory antibodies. A smooth surface (convex surface) is formed in a layered structure. On the 25th day of the month, the sun began to fall. In the early to middle stages of differentiation, TM is added to TM and stops on the way to differentiation. The late addition of, smooth surface The number of cells identified by the anti-tumor antibody, the number of cells identified by the anti-tumor When TM treatment is performed, the cells are labeled with anti-GFP·HA antibodies. In fact, DSB can be detected in all cells, and the staining image can be used to determine whether DSB is detected. In the future, it is necessary to establish a method for analyzing the effects of tissue aging on the whole tissue.