Lokalisierung und Funktion der Chemotaxis- und Motorkomponenten von Sinorhizobium meliloti: Eine in vivo Untersuchung unter Einsatz der FRET-Technik

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Die sensorische Signalkette zum Flagellenmotor in der Chemotaxis von Sinorhizobium meliloti unterscheidet sich vom gut untersuchten enterobakteriellen System in mindestens drei Punkten - Chemorezeption, Responsregulation und Motorfunktion. Den Schwerpunkt dieses Antrags bildet die Funktionsanalyse neuartiger Rezeptor-, Chemotaxis- und Motorkomponenten in vivo unter Einsatz der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Technik. Ein häufig verwendetes und etabliertes Fluorophorenpaar sind CFP und YFP, die mit den zu untersuchenden Proteinen fusioniert werden. Die FRET-Technik erlaubt eine zeitliche und räumliche Quantifizierung der interaktiven Dynamik von Proteinen in vivo. Chemorezeption: S. meliloti besitzt sieben membran-durchspannende und zwei lösliche Rezeptoren zur Wahrnehmung ihrer Umgebung und ihres metabolischen Zustandes. Chemorezeptoren bilden zur Signalamplifizierung ein dichtes Cluster am Zellpol aus. Die Wechselwirkung heterologer Rezeptoren in diesem Komplex soll nach Stimulierung mit unterschiedlichen Lockstoffen untersucht werden. Ein besonderes Augenmerk wird auf die Lokalisierung und Funktion der löslichen Rezeptoren gelegt. Ihre genetisch belegte wichtige Rolle bei der Chemokinesis (Erhöhung der Schwimmgeschwindigkeit als Bewegungsmodulator) soll mit einer Mutante ohne membran-durchspannende Rezeptoren gezielt untersucht werden. Responsregulation: Das rhizobielle Chemotaxissystem verfügt über zwei Responsregulatoren, CheY1 und CheY2. Aktives CheY2~P ist der dominante Regulator der Motorrotation, während CheY1 als Phosphatabfluss dient. Die Dephosphorylierung des akivierten Responsregulators (CheY2~P) verläuft über eine Retrophosphorylierungskaskade zurück auf CheA, welches dann wiederum freies CheY1 phosphoryliert. Ein weiteres neues Protein, CheX, ist an diesem Regulationskreis beteiligt. Die Wechselwirkung der vier Proteine miteinander soll qualitativ und quantitativ untersucht werden. Nach chemischer Stimulierung ist eine dynamische Änderung der Affinitäten von CheY1 und CheY2 zu CheA zu erwarten. Außerdem soll die postulierte Bindung von CheY2~P an den Flagellenmotor nachgewiesen werden. Flagellenmotor: Der S. meliloti-Flagellenmotor rotiert ausschließlich im Uhrzeigersinn, kann aber die Rotationsgeschwindigkeit modulieren. Zwei neuartige periplasmatische Motilitätsproteine, MotC und sein Chaperon, MotE, sind essentiell für die Rotation. Zu ihrer weiteren Charakterisierung soll die FRET-Methode erstmalig auf periplasmatische Proteine angewendet werden. Ihren Einsatz finden hier spezielle mRFP1-Mutantenproteine, deren korreke Faltung und Fluoreszenz im Periplasma gesichert ist. Damit könnten Lokalisierung und Dynamik von MotC am Motor mit und ohne Stimulus analysiert werden. Folgende Modellvorstellung zur Funktion von MotC leiten diese Experimente: MotC stabilisiert und rekrutiert die Statorkomponente MotB und sichert so die schnelle Rotation des Motors.