生体膜脂質の疎水性部分を可視化する逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法の開発

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現在まで、DNA・RNAと蛋白質の解析技術の飛躍的発展に伴い、多くの知見が集積している。しかしながら、脂質、特に生体膜脂質二重層の内側に局在する脂肪酸に関しては解析技術が少なく未知の点が多い。申請者らは急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法の開発によって膜脂質を特異的に標識することが可能となり、生体膜脂質の微細分布解明に成功した。しかしこのQF-FRL法が識別するのは膜脂質の“親水性頭部”の違いであるのに対し、 “疎水性尾部”の違いを明らかにできなかった。またQF-FRL法以外の方法によっても、疎水性尾部を標識することは困難であった。そこで本研究では、QF-FRL法の改良により逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法を開発し、生体膜における脂肪酸分布をナノレベルで解析する。近年、脂肪酸の中でも不飽和脂肪酸が、様々な生理機能に影響することがわかってきた。しかしその機序は不明である。本研究では逆転凍結レプリカ脂肪酸標識法の開発によって、疾患及び疾患改善と、脂肪酸代謝及び摂取との関連の解明を目的としている。細胞培養中にアルキン化した脂肪酸を投与することにより培養細胞あるいは組織に取り込ませ、それぞれの脂肪酸が細胞のどの部位から取り込まれ、その後どういう経路をたどり最終的に細胞内のどの部位に局在するのかを明らかにし、各種脂肪酸が持つ生理活性発現機序の解明を目指す。前年度は、培養組織の培養液中にアルキン化不飽和脂肪酸を入れ細胞内に取り込ませ、そのアナログが本来の内在性脂質と同様の性質を持つことを確認し、クリックケミストリー法により不飽和脂肪酸を標識することに成功した。今年度は、急速凍結・凍結割断レプリカ標識（QF-FRL）法の改良と並行し、オレイン酸以外のリノレン酸、リノール酸、アラキドン酸など様々な種類の脂肪酸においても同様の標識局在検索を試みた。