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微小変化型ネフローゼ症候群におけるDNAメチル化を指標とした病態診断法の開発

以DNA甲基化为指标的微小病变肾病综合征病理诊断方法的开发

基本信息

批准号：
25670265
负责人：
渡部登志雄
金额：
$ 2.5万
依托单位：
Gunma University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2013
资助国家：
日本
起止时间：
2013-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-25670265/
关键词：
ネフローゼ症候群ＤＮＡメチル化病態診断 DNAメチル化

项目摘要

微小変化型ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）は小児ネフローゼ患者の約７５％を占める主要な疾患であるが、大量の蛋白尿を呈するほかには病態・症状の変化をとらえることのできるマーカーは知られていない。本研究では研究者のグループが同定したＭＣＮＳ患者の病態の変化と相関してＤＮＡメチル化が変化する遺伝子８２種のDNAメチル化を指標としてMCNS患者の病態診断法を確立することを目標とする。検体の採取：本研究では蛋白尿を呈する再発期、治療により蛋白尿が消失した寛解期、および年齢・性別を一致させた健常ボランティア末梢血から単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離後、ナイーブＴ細胞を抗体磁気ビーズ法で分取しそのＤＮＡのメチル化の変化をメチル化感受性制限酵素処理・定量ＰＣＲ法によって解析する。再発時のサンプルを9患者分、寛解期２患者分のＰＢＭＣを採取・保存した。メチル化感受性制限酵素HpaII法によるDNAメチル化率の検出:８２遺伝子のうちＩＰＡ解析の結果、オントロジー解析、パスウェイ解析などの結果を総合して１２の遺伝子をターゲット遺伝子として選定した。ＭＩＡＭＩ法で用いたプローブを挟む上流・下流2か所のHapaII制限酵素サイト（CCGG)を挟む形で、メチル化検出プライマーを設計した。またHapaII制限酵素サイトの手前に、コントロールプライマーを設定した。CpGノンメチルＪｕｒｋａｔ　ＤＮＡをよび完全メチル化ＤＮＡを混合し、０－100%メチル化ＤＮＡを調整した。HpaII およびＭｓｐＩで完全消化し、設計したメチル化検出プライマーおよびコントロールプライマーを用いて定量ＰＣＲを行った。結果、プライマーにより、ＤＮＡのメチル化をよく反映するものもあるが、ほぼ増幅に変化がみられないものもあった。　今後診断に用いるためには、より慎重にプライマーの設計を行ってゆく必要があることが分かった。

Micro-degenerative syndrome (MCNS) accounts for about 75% of patients with micro-degenerative syndrome. The main disease is proteinuria. The symptoms of micro-degenerative syndrome are abnormal. The purpose of this study was to establish a diagnostic method for pathologies of MCNS patients based on the association of 82 DNA markers with pathologies of MCNS patients. In this study, we analyzed the development of proteinuria, the disappearance of proteinuria, the recovery period, the age, the gender, the normal state, the separation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC), the isolation of T cells, the isolation of DNA by antibody magnetic field, the detection of DNA by enzyme restriction and quantitative PCR. PBMCs were collected from 9 patients in recovery phase and 2 patients in recovery phase. The results of DNA analysis by HpaII method were summarized as follows:82 DNA samples were analyzed by IPA, 12 DNA samples were analyzed by PCR, and 12 DNA samples were selected. The MIAMI method is designed to control enzyme activity in the upper and lower streams. HapaII restriction enzyme is set in front of the user. CpG HpaII and MspI are fully digested, designed and quantified by PCR. The results are as follows: In the future, the diagnosis should be carefully designed.