Functional analysis of novel BMP antagonist as causal factor of kidney disease progression in diabetes

新型 BMP 拮抗剂作为糖尿病肾病进展致病因素的功能分析

• 批准号: 21K16173
• 负责人: 小林 洋輝
• 金额: $ 2.91万
• 依托单位: Nihon University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
• 财政年份: 2021
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2021-04-01 至 2024-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-21K16173/
• 关键词: NBL1; BMP-7; EMT; 糖尿病性腎症; NBL１; 腎線維化; BMP antagonist; 慢性腎臓病; オミクス

研究代表者はBone Morphogenetic Protein(BMP)-7のantagonistであるNeuroblastoma suppressor of tumorigenicity 1(NBL1)が将来の末期腎不全(ESRD) を強力に予測するバイオマーカーであることを明らかにした。またNBL1KOマウスが、UUOにより誘導した腎線維化に対して抵抗性があることがわかったが、腎線維化に関与する分子機序や、糖尿病性腎症でのNBL1の役割は未知であるため、これらを明らかとすることを目的とした。1) ヒト近位尿細管細胞であるHK-2細胞に、NBL1のsiRNAをトランスフェクションし、DMEM無血清培地でserum starvaitonを24時間行った後、TGFβ1 (5ng/ml)を培地に添加し４８時間刺激した。これらの細胞から蛋白を回収し、western blotを行った結果、negative control siRNAでは、TGFβ1の刺激によって、EMTのマーカーであるE-cadherinの発現がDMEM培地と比べて減少したが、NBL1 siRNAをトランスフェクションした細胞では、E-cadherinの減少が抑制された。またαSMAの発現は、negative control siRNAでは、その発現が上昇したが、NBL1 siRNAでは、コントロールsiRNAと比べると発現が低下していた。現在は、SMAD1/5、SMAD2/3のリン酸化への影響を検討中である。2) NBL1 KOマウス(ホモタイプ、ワイルドタイプ)を、麻酔下で右腎摘出を行った後に高脂肪餌を与え、ストレプトゾトシンを投与して糖尿病マウスを作成した。糖尿病発症確認後24週まで飼育後に麻酔下で心臓より全採血を行い、臓器を採取した。現在、組織でのmRNA、タンパクの発現解析や、組織染色を行なっている。

首席研究者表明，骨形态发生蛋白（BMP）-7的拮抗剂1（NBL1）的神经母细胞瘤抑制剂是一种生物标志物，是一种强烈预测未来终末期肾衰竭（ESRD）的生物标志物。此外，发现NBL1KO小鼠对UUO诱导的肾纤维化有抵抗力，但是参与肾纤维化的分子机制以及NBL1在糖尿病性肾病中的作用是未知的，因此我们旨在阐明这些。 1）用NBL1 siRNA转染HK-2细胞，一种人近端管状细胞，并用无DMEM血清培养基进行24小时的血清Starvaiton，然后将TGFβ1（5NG/mL）添加到培养基中并刺激48小时。从这些细胞中收集蛋白质，并进行蛋白质印迹。在阴性对照siRNA中，与DMEM培养基相比，在阴性对照siRNA中，E-钙粘着蛋白的表达降低了，但是在用NBL1 siRNA转染的细胞中，E-钙粘着蛋白的降低被抑制。此外，在阴性对照siRNA中增加了αSMA的表达，但与对照siRNA相比，NBL1 siRNA的表达降低。目前，我们正在研究SMAD1/5和SMAD2/3对磷酸化的影响。 2）在麻醉下右肾切除术后，NBL1 KO小鼠（同型和野生型）在高脂肪中得到高脂肪食物，并通过施用链霉菌素来制备糖尿病小鼠。确认糖尿病发作直到24周后，在麻醉下从心脏收集所有血液，并收集器官。目前，我们正在分析组织中mRNA和蛋白质的表达并进行组织染色。