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Novel Development of Gene Delivery for Inner Ear -Dual Vector Method-

内耳基因传递的新进展-双载体方法-

基本信息

批准号：
21K16832
负责人：
大道亮太郎
金额：
$ 2.83万
依托单位：
Okayama University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Early-Career Scientists
财政年份：
2021
资助国家：
日本
起止时间：
2021-04-01 至 2024-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでの検討で、蝸牛が成熟している生後4週目の野生型マウスに対し、Round window membrane + Canal fenestration法（以下RWM+CF法）で２種類のAdeno associated virus (以下AAV)を内耳に導入した。血清型タイプ２（以下AAV2）、血清型タイプ９（以下AAV9）を用い、それぞれのベクターには蛍光タンパクであるeGFP（緑色蛍光）とmCherry（赤色蛍光）を組み込んだ。その際の濃度は先行研究での濃度に合わせるように、各ベクター濃度はその半分の濃度とした。具体的な濃度は以下の通りである。AAV2- EGFP at 1.84 _ 10^12 GC/mL, AAV2-mCherry at 1.07 _ 10^12 GC/ mL, AAV9-EGFP at 1.2 _ 10^12 GC/mL, AAV9-mCherry at 1.24 _ 10^12 GC/mL。注射後２週間目に聴性脳幹反応で聴力を評価したところ、注射された側の耳と対側の未治療の耳を比較し、低音域から高音域にかけて明らかな聴力低下を認めず、Dual transductionによる聴毒性は認めないと判断した。聴力を評価した後に安楽死させた上で、側頭骨を採取し、内耳を取り出し、固定した。免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡による内有毛細胞及び外有毛細胞への感染率を検討した。AAV2同士の組み合わせでは内有毛細胞への導入効率は96.92%とsingleの場合と同様の高効率であった。外有毛細胞に対しては、ApexとMiddleにおいて90%以上の高効率を認めた一方で、Baseに関しては効率が低下しており、全体としては65.59%と他家の報告よりも高値ではあったが、singleの効率と比較すると低下を認めた。AAV2によるDual transductionは有毛細胞においてsingleと同様に高率に導入されており、遺伝子治療における高い有用性が示唆された。

圆窗膜+管开窗法（以下RWM+CF法）和腺相关病毒（以下AAV）内分泌入胞。血清型腺病毒2（以下AAV2）、血清型腺病毒9（以下AAV9）使用GFP、绿色荧光蛋白（绿色荧光）和Cherry（绿色荧光）标记。その際の濃度は先行研究での濃度に合わせるように、各ベクター濃度はその半分の濃度とした。具体的な濃度は以下の通りである。AAV 2- EGFP为1.84 _ 10^12 GC/mL，AAV 2-mCherry为1.07 _ 10^12 GC/ mL，AAV 9-EGFP为1.2 _ 10^12 GC/mL，AAV 9-mCherry为1.24 _ 10^12 GC/mL。注射用2-羟色胺核性逆转录酶抑制剂，注射用羟色胺核性逆转录酶抑制剂，未治愈的聴力を評価した後に安楽死させた上で、側頭骨を採取し、内耳を取り出し、固定した。免疫染色を行い、共焦点レーザー顕微鏡による内有毛細胞及び外有毛細胞への感染率を検討した。AAV2同种异型杂交瘤细胞内有毛细胞的增殖能力为96.92%，单个杂交瘤细胞的增殖能力较高。除有毛细胞癌外，Apex和Middle癌90%以上高投保率较低的一方，Base癌低投保率较低的一方，全身癌低投保率较低的一方，全身癌低投保率较低投保率较低的一方，全身癌低投保率较低的一方，全身癌低投保率较高的一方。AAV2重组腺病毒双转导无毛细胞转染orm单转导相同表达率高的导入orm申请，重组子转染表达率高的可用性展示。