ホスホリパーゼA_2の構造化学的研究と特異的阻害剤の開発

磷脂酶A_2的结构化学研究及特异性抑制剂的开发

• 批准号: 09771954
• 负责人: 友尾 幸司
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Osaka University of Pharmaceutical Sciences
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09771954/
• 关键词: ホスホリパーゼA_2; 蛋白質複合体; 結晶構造; トリプシン

本年度は,外分泌型ホスホリパーゼA2,(PLA2)の中でも,牛膵臓より得られるPLA_2に着目した.本酵素は,N-末端が7残基長い前駆体酵素(pro-PLA2)として膵臓より発現され,トリプシンによってその7残基が限定分解を受け活性型酵素となる.前駆体酵素と活性型酵素では,ミセル状の基質に対して全く異なった活性力を示す.そこでこの機能発現機構を分子レベルで解明するため、牛膵臓由来pro-PLA2とtrypsinとの複合体のX線結晶構造解析を目的とし、複合体結晶の作成を試みた。まず複合体の調製は、pro-PLA2がtrypsinにより分解されずに両蛋白質が結合出来ることを考慮し、反応溶液のpHを中性から酸性側に選択し、更にPLA2の活性発現に必須であるCa^<2+>を添加した。複合体の形成は、Sephadex G-50カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより確認した。複合体の結晶化条件の検討は,室温において蒸気拡散平衡法により行った。沈殿剤としては作用の異なる代表的な3種である、硫酸アンモニウム、ポリエチレングリコール4000、2-メチル2-4-ペンタンジオールを用い、これらの濃度および溶液のpHを7.0から4.0まで変化させた。様々な条件検討の結果、10〜15%濃度のポリエチレングリコールを用い、pH6.5の条件において板状の結晶を得ることが出来た。しかし、この結晶では充分なX線回折データを得ることが出来なかったため、現在、構造解析に使用可能な良質の結晶を得るべく結晶化条件の精密化を行っている。

This year, the exocrine type of 2,(PLA2) was found in the middle of the year, and 2 was found in the middle of the year. This enzyme is a 7-residue long precursor enzyme (pro-PLA2) at the N-terminal end. The enzyme activity of the precursor enzyme is expressed in a variety of substrates. The X-ray crystal structure analysis of the pro-PLA2 and trypsin complexes was carried out for the purpose of preparing the complex crystals. The modulation of the complex, the decomposition of pro-PLA2 into trypsin, the binding of protein, the pH of the reaction solution, the neutral acid side, and the addition of Ca^<2+> are necessary for the activity of PLA2. The formation of the complex was confirmed by Sephadex G-50. The crystallization conditions of the complex were investigated by evaporation and dispersion equilibrium method at room temperature. The three kinds of different functions of the precipitation agent are: sulfuric acid, sulfuric The results of the investigation of the conditions, the concentration of 10 ~ 15% of the mixed solution, the pH of 6.5 conditions for the formation of plate-like crystals, were obtained. X-ray diffraction analysis is used to obtain the crystallization conditions of good quality.

项目成果

Atsushi Yamamoto: "Binding Mode of CAO74,a Specific Irreversible Inhibitor,to Bovine Cathepsin B as Determined by X-Ray Crystal Analysis of the Complex" Journal of Biochemistry. 121. 974-977 (1997)

Atsushi Yamamoto：“通过复合物的 X 射线晶体分析确定 CAO74（一种特定的不可逆抑制剂）与牛组织蛋白酶 B 的结合模式”生物化学杂志。

Koji Tomoo: "X-Ray crystal structure determination and molecular dynamics simulation of pro phospholipase A_2 inhibited by amide-type substrate analogues" Biochimica et Biophysica Acta. 1340. 178-186 (1997)

Koji Tomoo：“酰胺型底物类似物抑制磷脂酶原 A_2 的 X 射线晶体结构测定和分子动力学模拟”Biochimica et Biophysica Acta。