精細胞を用いた新しい遺伝子導入動物作成法の開発

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本研究は、精細胞を用いて効率的に遺伝子導入動物を作成する方法を開発しようとするものである。動物は主にマウスを用いている。この目的のために、(1)精細胞への遺伝子導入→(2)精細胞の体外あるいは体内培養→(3)精細胞の回収→(4)遺伝子導入精子細胞選抜および顕微授精→(5)遺伝子導入産子の出産、という一連の技術の開発が必要である。昨年度までに、精細胞の遺伝子導入および体外培養については、ある程度の成果を得た。本年度は、遺伝子導入細胞の選抜と顕微授精を成功させるための技術開発を行った。これまでの円形精子細胞を用いた顕微授精は、卵子活性化45分後から60分後までの分後までの短時間に終了させる必要があった。そこで、2減数分裂中期で停止している未受精卵へ円形精子細胞を注入し、染色体凝集をさせた後に、サイトカラシン存在下で活性化し、1個の雌性前核を除くことで二倍体胚を作成した。この胚は胚移植後に正常産子まで発生した。この方法により、(GFP) Green Fluorescent Proteinなどのマーカーをもとに導入細胞を探す時間的余裕ができ、より確実に遺伝子導入細胞由来の産子を得られると考えられる。本年度は、さらに核移植技術を用いて、精祖細胞由来のクローン胚の作成を目指した。生後6-8日令の雄マウ.スから精巣を取り出し、精細管を酵素処理することにより精祖細胞を採取し、Wakayama et al.の方法によりクローン胚を作成した。これまで120個の胚を培養し、36個(30%)が桑実期胚/胚盤胞期胚へ発生し、そのうち23個(77%)が着床した。精祖細胞は、精母細胞や精子細胞に比べて培養が容易であるので、遺伝子導入と選抜も実施できる可能性が高い。今後、本研究で得られた成果をもとに、実際に遺伝子導入動物の作成を実施する予定である。