新規α1-3キシロシルトランスフェラーゼの構造と機能

新型α1-3木糖基转移酶的结构和功能

• 批准号: 12780454
• 负责人: 石水 毅
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780454/
• 关键词: 糖転移酵素; 血液凝固因子; EGF; キシロース; O-配糖体

血液凝固系タンパク質のEGF様ドメインのセリン残基にXylα1-3Xylα1-3Glcβ1-O-Serという特徴的なO-配糖体がみられる。今年度は、その生合成に関わるUDP-キシロース:β-グルコシドα1-3キシロシルトランスフェラーゼ(G酵素)の精製と、市販品として手に入らなくなったドナー基質であるUDP-キシロースの合成経路の確立、天然基質である血液凝固系タンパク質中のEGF様ドメインのセリン残基にグルコースのみがβ結合したペプチドの調製を計画した。ドナー基質UDP-キシロースの合成はUMP-イミダゾール体とキシロース-1-リン酸トリオクチルアンモニウム塩との縮合反応による合成経路を確立し、収率36%で合成したG酵素の精製はウシ肝臓を出発材料とした。遠心分離による膜画分の分画後、DEAE陰イオン交換クロマトグラフィー、Sephacryl S-200ゲル濾過クロマトグラフィー、MonoQ陰イオン交換クロマトグラフィー、UDP-ヘキサノールアミンアガロースクロマトグラフィー、の順に展開することで、SDS-PAGE上で単一バンド(48kD)になる精製標品を得た。精製酵素は至適pHは7付近、Mn2+によって活性化され、Cu2+,Fe2+により不活性化された。ドナー基質UDP-キシロースに対するKm値は40μM、アクセプター基質2-[2-ピリジルアミノ]エチルβ-D-グルコピラノシドに対するKm値は530μMであった。現在、G酵素の遺伝子クローニングに向けてアミノ酸配列を解析している。また、東海大学北條助教授との共同グループにより、天然基質である血液凝固系タンパク質中のEGF様ドメインのセリン残基にグルコースのみがβ結合したペプチドの化学合成を試みている。これまでにグルコースがセリン残基に結合した糖ペプチドの合成、ウシEGF様ドメインに含まれるペプチドセグメントの合成を行った。現在、それら各セグメントのライゲーション反応、および、ジスルフィド結合の条件を検討している。

Blood coagulation system タ ン パ ク qualitative の EGF others ド メ イ ン の セ リ ン residues に Xyl alpha 1-3 Xyl alpha 1-3 GLC beta 1 - O - Ser と い う, 徴 な O - glycoside が み ら れ る. Our は, そ の biosynthesis に masato わ る UDP - キ シ ロ ー ス : beta グ ル コ シ ド alpha 1-3 キ シ ロ シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ の refined と enzyme (G), city, vendor product と し て hand に into ら な く な っ た ド ナ ー matrix で あ る UDP - キ シ ロ ー ス synthetic 経 の way の establishment, natural matrix で あ る blood coagulation system タ ン パ ク の E in the mass GF others ド メ イ ン の セ リ ン residues に グ ル コ ー ス の み が beta combine し た ペ プ チ ド の を modulation plan し た. ド ナ ー matrix UDP - キ シ ロ ー ス の synthetic は UMP party - イ ミ ダ ゾ ー ル body と キ シ ロ ー ス - 1 - リ ン acid ト リ オ ク チ ル ア ン モ ニ ウ ム salt と の condensation anti 応 に よ る synthetic を established し 経 road, 収 rate 36% で synthetic し た G enzyme の refined は ウ シ routine liver を 発 material と し た. After telecentric separation of による membrane paintings and partition division, DEAE perineal and perineal <s:1> ロ exchange, ロ ロ トグラフィ トグラフィ, and Sephacryl S - 200 ゲ filtration ク ル ロ マ ト グ ラ フ ィ ー, MonoQ Yin イ オ ン exchange ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー, UDP - ヘ キ サ ノ ー ル ア ミ ン ア ガ ロ ー ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー, に の expand す る こ と で, sds-page で 単 a バ ン ド (48 kd) に な る refined standard product を た. Refined enzymes <s:1> to an optimal pH <e:1> of nearly 7, Mn2+によって activated され, Cu2+ and Fe2+によ inactivated された. UDP ド ナ ー matrix - キ シ ロ ー ス に す seaborne る Km numerical は 40 microns, ア ク セ プ タ ー substrate 2 - [2 - ピ リ ジ ル ア ミ ノ] エ チ ル beta - D - グ ル コ ピ ラ ノ シ ド に す seaborne る Km numerical は 530 mu M で あ っ た. Now, G enzyme の but 伝 ク ロ ー ニ ン グ に to け て ア ミ ノ acid with column を parsing し て い る. ま た, tokai university north assistant professor と の common グ ル ー プ に よ り, natural matrix で あ る blood coagulation system タ ン パ ク qualitative の EGF in others ド メ イ ン の セ リ ン residues に グ ル コ ー ス の み が beta combine し た ペ プ チ ド の chemical synthesis を try み て い る. こ れ ま で に グ ル コ ー ス が セ リ ン residues に combining し た sugar ペ プ チ ド の synthesis, ウ シ EGF others ド メ イ ン に containing ま れ る ペ プ チ ド セ グ メ ン ト の synthetic line を っ た. Now, そ れ ら each セ グ メ ン ト の ラ イ ゲ ー シ ョ ン 応, お よ び, ジ ス ル フ ィ ド の conditions を beg し 検 て い る.

项目成果

Norioka et al.: "Sequence comparison of the 5'flanking regions of Pyrus pyrifolia S-RNases associated with gametophytic self-incompatibility."Sexual Plant Reproduction. (印刷中). (2001)

Norioka 等人：“与配子体自交不亲和性相关的梨树 5 侧翼区域的序列比较”。有性植物繁殖（2001 年出版）。

Norioka et al.: "Sequence comparison of the 5' flanking regions of Pyrus pyrifolia S-RNases associated with gametophytic seif-incompatibility"Sexual Plant Reproduction. 13(5). 289-291 (2001)

Norioka 等人：“与配子体自交不亲和性相关的梨树 S-RNases 5 侧翼区域的序列比较”有性植物繁殖。

Skirpan A.L. et al.: "Isolation and Characterization of Kinase Interacting Protein 1, a Pollen Protein That Interacts with the Kinase Domain of PRK1, a Receptor-Like Kinase of Petunia"Plant Physiology. 126(4). 1480-1492 (2001)

Skirpan A.L. 等人：“激酶相互作用蛋白 1 的分离和表征，这是一种与 PRK1 激酶结构域相互作用的花粉蛋白，PRK1 是矮牵牛的受体样激酶”植物生理学。

Klyozumi D. et al.: "Pollen UDP-glucose pyrophosphorylase showing polymorphism well-correlated to the S genotype of Pyrus pyrifolia"Sexual Plant Reproduction. (印刷中). (2002)

Klyozumi D.等人：“花粉UDP-葡萄糖焦磷酸化酶显示出与梨叶S基因型良好相关的多态性”有性植物繁殖（2002年出版）。