ジーンノックアウト法を用いたヒストンデアセチラーゼ-3の機能解析

利用基因敲除法分析组蛋白脱乙酰酶3的功能

• 批准号: 12780514
• 负责人: 高見 恭成
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: 宮崎医科大学
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12780514/
• 关键词: ヒストン; アセチル化; クロマチン構造; ヒストンデアセチラーゼ; DT40細胞; ジーンノックアウト法; 細胞増殖

クロマチン構造は種々の要因により多様な動態をとり、様々なDNAの機能発現(複製、転写、修復、組換え等)に関与していると考えられる。クロマチンは基本的にはヌクレオソーム鎖の集合であり、このヌクレオソームの構成員であるヒストンのアセチル化等の修飾がヌクレオソーム鎖の凝縮、伸張に密接に関与している。ヒストンデアセチラーゼ(HDAC)は酵母では5種、ヒトでは10種の遺伝子(HDAC1-10)が見い出され、いずれのHDACもRPD3 familyに共通に保存されたドメインを有している。しかしながら、他の領域の相同性は低く、いくつかのHDACは異なる複合体中に存在することから、各HDACは互いにredundantな則面と機能的に異なる面を持つものと考えられる。申請者は遺伝学的解析が比較的容易なニワトリBリンパ細胞株DT40を用いて、各chHDAC欠失変異株を作成することにより、これらの機能解析を試みている。HDAC1及びHDAC2に関しては、各々単独欠損では細胞の増殖可能であるが、両者のdouble mutantはlethalであること、chHDAC-2がBリンパ球におけるIgM重鎖遺伝子の転写促進とIgMの膜型mRNAから分泌型mRNAへのスイッチングに深く関与していることを示している。本研究では主にchHDAC-3の機能解析を行った。chHDAC-3はchHDAC-1,2と比べて、C-末端側の約50アミノ酸が欠如し、さらに、N-末端およびC-末端側でのホモロジーも低い。細胞増殖に必須である本酵素に関して、tet-inducible conditional homozygous mutantの作成に成功した.本変異株はtet添加後24時間でFLAG-tagged HDAC-3が検出出来なくなり、しばらくは正常に増殖するが、以後、増殖速度が遅くなり、死滅する。増殖にはchHDAC-3のN-末端側およびC-末端側の各々約150個のアミノ酸、核外輸送シグナル(NES)とデアセチラーゼ活性が必須であった。本変異株はHDAC1,2の過剰発現により相補されないことから、HDAC3独自の細胞増殖調節機能を持つことが示された。したがって、高等真核生物の細胞増殖にはHDACsの関与する独立した2種の経路があることが示唆された。

The structure of DNA is related to the development of DNA functions (replication, transcription, repair, and transformation). The basic structure of the system is composed of a set of components, such as a set of components, and a set of components. 5 species of yeast and 10 species of yeast (HDAC1-10) are commonly preserved in the HDAC and RPD3 family. The similarity between HDAC and other fields is low, and the HDAC is different in complex. The HDAC is different in function. The HDAC is different in function. The applicant is easy to analyze the genetic analysis and test the function analysis of the cell line DT40. HDAC-1 and HDAC-2 are related to cell proliferation, which is possible due to their unique impairments. The IgM relocked-in gene expression is promoted by IgM membrane-type mRNA and secretory mRNA. This study is aimed at analyzing the function of chHDAC-3. chHDAC-3 is opposite to chHDAC-1,2 and has about 50 ° C on the C-terminal side. Cell proliferation requires the production of this enzyme, tet-inducible conditional homozygous mutant. 24 hours after the addition of tet, HDAC-3 was detected, propagated normally, and died. About 150 amino acids, 150 extracellular transport molecules (NES) and 150 amino acid residues are required for each of the N-terminal and C-terminal sites of chHDAC-3. These mutants complement HDAC1 and HDAC 2 in their development and HDAC3 alone in its regulation of cell proliferation. The relationship between HDACs and cell proliferation in higher eukaryotes is shown in two separate ways.

项目成果

Nakayama, T.: "Participation of histones and histone-modifying enzymes in cell functions through alterations in chromatin structure"J.Biochem.. 129. 491-499 (2001)

Nakayama, T.：“组蛋白和组蛋白修饰酶通过染色质结构的改变参与细胞功能”J.Biochem.. 129. 491-499 (2001)

Ahmad, A.: "Leucine zipper motif of chicken histone acetyltransferase-1 is essential for in vivo and in vitro interactions with the p48 subunit of chicken chromatin assembly factor-1"Nucleic Acids Res.. 29. 629-637 (2001)

Ahmad, A.：“鸡组蛋白乙酰转移酶 1 的亮氨酸拉链基序对于体内和体外与鸡染色质组装因子 1 的 p48 亚基的相互作用至关重要”《核酸研究》29. 629-637 (2001)

Takami,Y.: "N-terminal region, C-terminal region, nuclear export signal and deacetylation activity of histone deacetylase-3 are essential for the viability of the DT40"J.Biol.Chem.. 275. 16191-16202 (2000)

Takami,Y.：“组蛋白脱乙酰酶 3 的 N 末端区域、C 末端区域、核输出信号和脱乙酰活性对于 DT40 的生存能力至关重要”J.Biol.Chem.. 275. 16191-16202 (2000