マウス脳組織におけるリアノジンレセプターの分子レベルでの局在解析方法の確立

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研究目的:神経細胞におけるリアノジンレセプター分子を電子顕微鏡による細胞質内器官レベルで観察することで、より正確な細胞同定や細胞質内局在の見知を得て、分子レベルでのリアノジンレセプターによるカルシウム流動性を推測する。研究方法:リアノジンレセプター特異的抗体を作成、免疫組織化学的手法により、細胞レベルでの解剖学的知見を得ており、これらのデーターを参考に、金コロイド法によって,電子顕微鏡にて分子レベルで観察し、その局在を解析する。研究成果:リアノジンレセプター分子を観察したところ、固定液の濃度により、反応の強弱が著しく異なった。このため、グルタルアルデヒド溶液を0.1%、ホルマリン溶液を2%で固定した条件が最も特異性の高い反応を得ることができた。また、界面活性剤を使用した場合、反応は強くなるが、細胞質内器官の微細構造が破壊、不明瞭となるため、不適と思われた。凍結切片標本においては、反応は強くなるものの、非特異的反応が著しくさらには、細胞質内器官微細構造が不明瞭など観察には不適であったため、従来通りのエポン包埋法でデーター解析をした。反応の特異性としては、メッセンジャーRNAの発現分布や、カルシウム貯蔵器官に特異的に反応していることで、ほぼ達成できたと考える。分子解剖学的所見として、リアノジンレセプター1は、小脳プルキンエ細胞樹状突起に優位に発現しており、リアノジンレセプター2は、小脳分子層である平行線維(小脳顆粒細胞からの軸索)に発現し、プルキンエ細胞には発現は認められなかった。免疫電子顕微鏡による観察においては、カルシウム貯蔵器官である滑面小包体に隣接するように確認され、神経細胞におけるリアノジンレセプターによる細胞質内カルシウム放出現象を形態学的に立証できたと思われる。また、神経伝達部位であるシナプス領域には観察はされず、主に細胞質、樹状突起や軸索などの滑面小包体に局在し、神経終末には存在しないことも分かった。現在、論文においては投稿中であるが、受理の結果待ちであります。