末梢血中の微量白血病細胞定量検出に有用なエマルジョンPCR法の確立と臨床応用

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白血病など血液疾患に対する化学療法後の治療反応性や骨髄移植後の再発評価において、微小残存病変の評価は、重要である。また、原発巣以外での再発を考えると循環末梢血中に存在する腫瘍細胞を早期に高感度に検出・定量することは有用と考えられる。これまで遺伝子変異(主に一塩基変異)を腫瘍細胞マーカーとした遺伝子変異特異的PCR法を検討し、ロック核酸(locked nucleic acid, LNA)およびミスマッチ塩基を含有する遺伝子変異特異的プライマーを使用することで、特異度および感度が高いPCR法を検討してきた。本研究では、定重的な評価を行うことを目的としてLNA、ミスマッチ含有プライマーを使用したエマルジョンPCR法とPCR産物を蛍光量として定量する反応系の検討を行った。エマルジョン作製では、ミネラルオイル、非極性界面活性剤および乳化剤を使用し、超音波装置、微小ビーズを用いた懸濁方法などを試行した。しかし、エマルジョン状態が長時間持続せず、PCRを行うと初期ステップ(変性過程)で既にエマルジョン状態が消失していた。簡便かっPCRに適したエマルジョン作製のために試薬組成や懸濁方法の検討がさらに必要である。そのため、その後の定量的評価を目的とした検出系の検討では、プライマー固相化ビーズを用いてPCRを行う替わりに、はじめにLNA、ミスマッチ含有変異特異的プライマーとFAM標識共通プライマーを用いて遺伝子変異特異的PCR法を行った後に、正常配列特異的なプローブを固相化したビーズとPCR産物をハイブリダイゼーションさせ、ビーズを遠心回収した後に再溶解し蛍光量を測定した。野生型DNAに変異型DNAを混和した希釈系列を用いて、感度および特異度を検討した結果、0.01%～0.001%の変異型DNAを検出できた。また、野生型DNAには反応が認められなかった。正確な定量性が今後の課題である。