糖鎖抗原を標的としたキメラ抗原受容体発現T細胞の構築と抗腫瘍効果の検討

靶向碳水化合物抗原的嵌合抗原受体表达T细胞的构建及抗肿瘤作用研究

• 批准号: 24931034
• 负责人: 松田 和之
• 金额: $ 0.38万
• 依托单位: Shinshu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Scientists
• 财政年份: 2012
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2012 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-24931034/
• 关键词: 遺伝子改変T細胞療法; キメラ抗原受容体; 糖鎖抗原

【研究目的】近年、米国を中心に、癌抗原に特異的なキメラ抗原受容体(chimeric antigen receptor, CAR)を用いた遺伝子改変T細胞療法の開発が進められ、良好な臨床効果が報告されている。CARは、(1)標的抗原の免疫原性や免疫寛容に影響を受けない、(2)HLA非拘束性に抗腫瘍効果を発揮する、(3)生体内のT細胞が抗原として認識できない糖鎖や糖脂質も標的にできるなどの特徴がある。本研究では、CARの標的として糖鎖抗原、特にThomsen-Friedenreich(TF抗原,CD176,Galβ1-3GalNAc-0-Ser/Thr)に注目した。TF抗原は正常細胞では、末端がシアル化されているが、腫瘍細胞では、脱シアル化されたTF抗原として乳癌、大腸癌、肝臓癌など多くの癌に様々な程度で発現している代表的な癌特異的糖鎖抗原の1つである。【研究成果】(1)脱シアル化TF抗原を認識するモノクローナル抗体産生ハイブリドーマから、mRNAを抽出し、重鎖、軽鎖からなるsingle chain Fv (scFv)を作製した。分泌シグナル配列および免疫グロブリン定常領域のヒンジドメインをコードする塩基配列を付加し、最終的に、(分泌シグナル配列)-(抗TF抗体ScFv)-(ヒンジ配列)のコンストラクトを作製した。さらに、CARの細胞質内ドメイン(CD28・T細胞受容体zeta鎖複合体)と本研究で作製したコンストラクトを結合させ、TF-CARベクターを作製した。(2)抗CD3抗体およびIL2により刺激した末梢血T細胞へTF-CARベクターを導入後、フローサイトメトリー(FACS)法によりTF-CAR発現率を確認した結果、25～46%のT細胞でTF-CARの発現が確認された。さらに、免疫グロブリン定常領域に対する抗体を用いて、磁気ビーズ法によってTF-CAR発現細胞の回収が可能であることを確認した。(3)がん細胞上でのTF抗原の発現状態をFACS法により解析した。MCF7(ヒト乳がん細胞由来細胞)では、既に脱シアル化TFの状態であることが確認できた。MCF7は抗腫瘍細胞効果の対象細胞として使用できると考えた。一方、糖鎖.合成不全の変異CHO細胞株であるLec2細胞では、脱シアル化TFが発現していることを確認した。一方の正常のCHO細胞ではシアル化TF抗原が発現していた。TF-CARを用いた抗腫瘍細胞効果の判定では、Lec2を陽性コントロール、CHOを陰性コントロールとして使用できると考える。今後の計画では、まず、MCF7を用いたTF-CARによる抗腫瘍細胞効果の評価を行いたい。

[Objective] In recent years, the development of antigen-specific chimeric antigen receptor (CAR) modified T cell therapy has been reported in China, and good clinical results have been reported. CAR is affected by (1) immunogenicity and immune tolerance of the target antigen,(2) development of HLA nonbinding anti-tumor effect, and (3) identification of antigen and carbohydrate lipid targets by T cells in vivo. In this study, we focused on the target of CAR, especially Thomsen-Friedenreich(TF antigen, CD176,Galβ1-3GalNAc-0-Ser/Thr). TF antigen is a cancer-specific carbohydrate lock antigen that is expressed in breast cancer, colorectal cancer, liver cancer, and many other cancers. [Research Results](1) The production of anti-TF antibody, mRNA extraction, re-locking and re-locking of single chain Fv (scFv) was studied. Secretion and Immunization: A Study of the Secretion and Immunization of Anti-TF Antibody ScFv and Anti-TF Antibody ScFv In this study, the cytosolic receptor of CAR (CD28·T cell receptor zeta lock complex) and TF-CAR were controlled. (2)After the introduction of TF-CAR into peripheral blood T cells stimulated by anti-CD3 antibody and IL2, TF-CAR detection rate was confirmed by FACS method. As a result, TF-CAR detection rate was confirmed in 25~46% of T cells. This is a confirmation of the possibility of recovery of TF-CAR cells by the use of antibodies in the immune system and by the magnetic field method. (3)The expression status of TF antigen on cells was analyzed by FACS. MCF7(milk derived cell) is confirmed by the status of TF. MCF7 is a tumor-resistant cell and a target cell. One side, sugar lock. The synthesis of mutant CHO cell lines was confirmed in Lec2 cells. A normal CHO cell was found to contain TF antigen. TF-CAR is used to determine the effect of anti-tumor cells, Lec2 is used to determine the effect of anti-tumor cells, CHO is used to determine the effect of anti-tumor cells In the future, TF-CAR and anti-tumor cell evaluation will be carried out in the application of MCF7.