多光子レーザー顕微鏡による肝臓観察法の改善

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【目的】申請者の所属する研究室では、蛍光生体イメージングの手法を用いてマラリアの感染の現場である肝臓や脾臓を直接観察する研究を行なっている。肝臓のイメージングにあたっては、皮膚を切開して肝臓を露出させ、倒立型多光子レーザー顕微鏡で観察を行なった。その際に大きな障害となった問題は、生きたマウスを顕微鏡で観察するために拍動や呼吸によるマウスの動きをいかに抑えるか、また長時間にわたる撮影中露出させた肝臓を乾燥などのダメージからいかに守るかという点であった。拍動の影響を抑えるためには、臓器を露出させマウスの体から離すことが有効と考えられる。そうした場合に臓器の乾燥を防ぐ工夫が必要である。本研究は、安価なプラスチック製品などを加工してカバーを作成し腹腔外に取り出した臓器の乾燥を防ぎ、長時間の観察に耐えられる方法を開発することを目的とする。【方法】マウスをイソフルランで麻酔して腹部を剃毛し、正中切開により肝臓を腹腔外に取り出し、倒立型多光子レーザー顕微鏡で観察を行なった。マウスは、観察台の上に横向きに寝かせ、肝臓が対物レンズの直上に乗るように、養生テープで固定した。市販のプラスティックシャーレを加工してカバーを作成し、裏返しに重ね合わせることで肝臓を固定した。乾燥防止のため、肝臓にはPBSを適量滴下し、カバーは養生テープまたはネジでステージに固定した。組織のダメージは、血流の低下という形で現れるため、マウスにQtracker655を尾静脈から投与し、血流を観察することにより、組織のダメージを評価した。【結果、考察】肝臓は柔らかい臓器であるため、固定の力が強すぎるとダメージを受け、逆に弱すぎると拍動や呼吸による動きを制御できなかった。適切な力で固定すると、拍動などによる動きを抑えることが確認できたが、固定の方法には改善の余地がある。