アクチン調節タンパク質ゲルゾリンに相互作用するタンパク質(GIP)のクローニング

肌动蛋白调节蛋白凝溶胶蛋白相互作用蛋白 (GIP) 的克隆

• 批准号: 08770079
• 负责人: 藤田 寿一
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770079/
• 关键词: ゲルゾリン; ゲルゾリンに結合タンパク質; Rho; Rac; CDC42; Two-hybrid System; Far-western blotting法

近年、低分子量Gタンパク質のサブファミリーであるRho/Rac/CDC42は細胞骨格の再構築に関係し、様々な細胞の運動性や癌細胞の転移にも関与していることが明らかにされてきている。細胞の運動性は、アクチンの重合-脱重合により規定されており、アクチン調節タンパク質ゲルゾリンはアクチンに対して、直接的に作用するエフェクター分子であるが、また同時にRho/Rac/CDC42からの細胞骨格再構築のためのシグナルのアクセプターであると考えられる。本研究では、酵母を利用したTwo-hybrid SystemやグルタチオンSトランスフェラーゼフュージョン・タンパク質をプローブに用いてFar-western blotting法を用いて、ゲルゾリンと相互作用するタンパク質(GIP)を同定し解析することで、Rho/Rac/CDC42からの細胞骨格の再構築シグナル・カスケードを明らかにすることを目的とする。1)ゲルゾリンに相互作用するタンパク質(Gelsolin Interacting Protein = GIP)のcDNAクローニングa)酵母の転写因子であるGal4のDNA結合領域を有する発現ベクターに翻訳フレームが一致するようにゲルゾリンcDNAを組み、選別用酵母細胞株に導入した。さらにMouse brain cDNAライブラリー5×10^5クローンをトランスフェクションし、選択培地で生存する酵母クローンを得てcDNA (MB#3およびMB#10)を回収した。ジデオキシ法により、それらの塩基配列を決定し、遺伝子バンクを検索した結果、クローニングしたcDNAはmitocondria由来疎水性タンパク質(MB#3)およびagrin (MB#10)とのホモロジーが検出されたが、いづれの場合にも短いアミノ酸しかコードしておらず、GIPの候補cDNAとは考え難く以下に記す方法に変更した。2)ゲルゾリンに相互作用するタンパク質(Gelsolin Interacting Protein = GIP)の検索ゲルゾリンのN末端約半分G1-3およびC末端約半分G3-6cDNAをグルタチオンSトランスフェラーゼ・タグを有する大腸菌での発現ベクターに組み込み発現して、グルタチオン・カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。これらのフュージョン・タンパク質をプローブに用いて、Far-western blottingによりマウス線維芽細胞NIH/3T3の細胞抽出液を解析したところ解析したところ、分子量約72,000の、ゲルゾリンのN末端約半分G1-3に特異的に結合するタンパク質を見い出した。今後、ゲルゾリンのN末端約半分G1-3のフュージョン・タンパク質をプローブに用いて、NIH/3T3の発現ライブラリーをスクリーニングし、ゲルゾリンに相互作用するタンパク質(Gelsolin Interacting Protein = GIP) cDNAをクローニングし、cDNAの特徴的な配列、また既知の遺伝子であるかどうかについて検索し、その細胞生物学的解析を抗血清あるいはモノクローナル抗体を作製し免疫組織学的手法などを用いて細胞内での局在を検討していく予定である。

In recent years, low molecular weight G molecules have been found in the structure of Rho/Rac/CDC42 cells, and the relationship between cell motility and migration of cancer cells has been clarified. Cell mobility, overlap and declination regulation, direct action, and cellular remodeling of Rho/Rac/CDC42. In this study, yeast was used in the study of the use of Two-hybrid System to determine the identity of the cytoskeleton by Far-western blotting method, and Rho/Rac/CDC42 was used to determine the identity of the cytoskeleton by Far-western blotting method. 1) cDNA library of Gelsolin Interacting Protein (GIP) a) DNA binding domain of Gal4, a yeast writing factor, can be found in the DNA binding domain. If the cDNA library is consistent, the Gelsolin cDNA must be assembled and introduced into a selected yeast cell line. The Mouse brain cDNA was cloned from 5×10^5 cDNA fragments, and cDNA fragments (MB#3 and MB#10) were obtained from the mouse brain cDNA fragments. The method of determining the base sequence of GIP is described below. The method of detecting the base sequence of GIP is described below. The method of detecting the base sequence of GIP is described below. 2) Gelsolin Interacting Protein (GIP) is a protein that encodes G1-3 and G3- 6 cDNA at the N-terminal and C-terminal ends of the protein. The molecular weight of NIH/3T3 cells was about 72,000, and the N-terminal of NIH cells was about half of G1-3. In the future, the N-terminal half of the molecule G1-3 will be used for the development of the molecule, NIH/3T3 will be used for the development of the molecule, and the interaction between the molecule and the molecule will be discussed.(Gelsolin Interacting Protein = GIP) cDNAs are classified, cDNAs are characterized, and known genes are identified.

项目成果

Watari, H., Ogiso, Y., et al: "Dome formation induced by v-H-ras oncogene in a human choriocarcinoma cell line." Placenta. 17. 443-449 (1996)

Watari, H.、Ogiso, Y. 等人：“v-H-ras 癌基因在人绒毛膜癌细胞系中诱导圆顶形成。”

Furuuchi, K., Fujita, H., et al: "Gelsolin as a suppressor of malignant phenotype in human colon cancer." Tumor Targeting. (in press). (1997)

Furuuchi, K.、Fujita, H. 等人：“凝溶胶蛋白作为人类结肠癌恶性表型的抑制剂。”