アクチン調節タンパク質ゲルゾリンに相互作用するタンパク質(GIP)のクローニング

肌动蛋白调节蛋白凝溶胶蛋白相互作用蛋白 (GIP) 的克隆

基本信息

批准号：
08770079
负责人：
藤田寿一
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08770079/
关键词：
ゲルゾリンゲルゾリンに結合タンパク質 Rho Rac CDC42 Two-hybrid System Far-western blotting法

项目摘要

近年、低分子量Gタンパク質のサブファミリーであるRho/Rac/CDC42は細胞骨格の再構築に関係し、様々な細胞の運動性や癌細胞の転移にも関与していることが明らかにされてきている。細胞の運動性は、アクチンの重合-脱重合により規定されており、アクチン調節タンパク質ゲルゾリンはアクチンに対して、直接的に作用するエフェクター分子であるが、また同時にRho/Rac/CDC42からの細胞骨格再構築のためのシグナルのアクセプターであると考えられる。本研究では、酵母を利用したTwo-hybrid SystemやグルタチオンSトランスフェラーゼフュージョン・タンパク質をプローブに用いてFar-western blotting法を用いて、ゲルゾリンと相互作用するタンパク質(GIP)を同定し解析することで、Rho/Rac/CDC42からの細胞骨格の再構築シグナル・カスケードを明らかにすることを目的とする。1)ゲルゾリンに相互作用するタンパク質(Gelsolin Interacting Protein = GIP)のcDNAクローニングa)酵母の転写因子であるGal4のDNA結合領域を有する発現ベクターに翻訳フレームが一致するようにゲルゾリンcDNAを組み、選別用酵母細胞株に導入した。さらにMouse brain cDNAライブラリー5×10^5クローンをトランスフェクションし、選択培地で生存する酵母クローンを得てcDNA (MB#3およびMB#10)を回収した。ジデオキシ法により、それらの塩基配列を決定し、遺伝子バンクを検索した結果、クローニングしたcDNAはmitocondria由来疎水性タンパク質(MB#3)およびagrin (MB#10)とのホモロジーが検出されたが、いづれの場合にも短いアミノ酸しかコードしておらず、GIPの候補cDNAとは考え難く以下に記す方法に変更した。2)ゲルゾリンに相互作用するタンパク質(Gelsolin Interacting Protein = GIP)の検索ゲルゾリンのN末端約半分G1-3およびC末端約半分G3-6cDNAをグルタチオンSトランスフェラーゼ・タグを有する大腸菌での発現ベクターに組み込み発現して、グルタチオン・カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。これらのフュージョン・タンパク質をプローブに用いて、Far-western blottingによりマウス線維芽細胞NIH/3T3の細胞抽出液を解析したところ解析したところ、分子量約72,000の、ゲルゾリンのN末端約半分G1-3に特異的に結合するタンパク質を見い出した。今後、ゲルゾリンのN末端約半分G1-3のフュージョン・タンパク質をプローブに用いて、NIH/3T3の発現ライブラリーをスクリーニングし、ゲルゾリンに相互作用するタンパク質(Gelsolin Interacting Protein = GIP) cDNAをクローニングし、cDNAの特徴的な配列、また既知の遺伝子であるかどうかについて検索し、その細胞生物学的解析を抗血清あるいはモノクローナル抗体を作製し免疫組織学的手法などを用いて細胞内での局在を検討していく予定である。

近年来，已经揭示了Rho/RAC/CDC42是低分子量G蛋白的亚家族，参与了细胞骨架重建，并参与了各种细胞和癌细胞转移的运动。细胞运动性是由肌动蛋白聚合 - 脱聚合定义的，肌动蛋白调节的蛋白质凝胶蛋白是直接作用于肌动蛋白的效应分子，但也被认为是Rho/RAC/CDC42的细胞骨架重建信号的受体。这项研究旨在使用基于酵母的两杂交系统和谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白作为探针鉴定和分析与凝胶蛋白（GIP）相互作用的蛋白质，并阐明来自Rho/RAC/CDC42的细胞骨架重建信号级联。 1）与凝胶素相互作用的蛋白质（凝胶蛋白相互作用蛋白= GIP）的cDNA克隆a）与具有酵母转录因子Gal4的DNA结合区域的表达矢量结合的凝胶素cDNA，即酵母转录因子，因此将翻译框架匹配，并引入酵母细胞线以进行选择。此外，转染了小鼠脑cDNA库5×10^5克隆，并在选择性培养基中获得了存活的酵母克隆以收集cDNA（MB＃3和MB＃10）。它们的基本序列通过二氧化法确定并搜索基因库，并发现克隆的cDNA与线粒体衍生的疏水蛋白（MB＃3）和Agrin（MB＃10）具有同源性，但在每种情况下，它们只能想像一下编码的cdna，因此很难想象它的编码方法，因此可以将其描述为GIP，因此可以将其描述为GIP，因此可以将其描述为GIP。 2）搜索凝胶素相互作用蛋白（GIP）大约一半的G1-3和凝胶素的G3-6 cDNA的C末端一半被整合到大肠杆菌中的表达载体中，并用谷胱甘肽S-转移酶标记将其整合到大肠杆菌中，并使用粘贴柱使用亲和色谱法纯化。使用这些融合蛋白作为探针，通过远方的印迹分析了小鼠成纤维细胞NIH/3T3的细胞提取物，并且在进行分析时，发现分子量约为72,000的蛋白被发现特异性结合，与G1-3的大约G1-3的凝胶蛋白的大约一半结合。将来，我们将使用G1-3的大约一半的融合蛋白（是Gelsolin的N末端）筛选NIH/3T3的表达式库，克隆与凝胶蛋白相互作用的cDNA（凝胶蛋白相互作用蛋白= GIP），在cDNA和是否在cDNA中使用cDNA的特征性分析，并确定基因的特征性分析，以确定其cDNA的特征性分析，并且是否存在cDNA的特征性分析。技术。