血管新生における内皮細胞の運動性の分子機構解明

阐明血管生成过程中内皮细胞运动的分子机制

基本信息

批准号：
09770089
负责人：
藤田寿一
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度の研究において、ゲルゾリンのN末端約半分G1-3およびC末端約半分G4-6cDNAをGSTタグを有する大腸菌での発現ベクターに組み込み発現して、グルタチオン・カラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。これらのフュージョン・タンパク質をプローブに用いて、Fac-western blottingによりマウス線維芽細胞NIH/3T3の細胞抽出液を解析したところ解析したところ、分子量約72kDaのゲルゾリンのN末端約半分G1-3に特異的に結合するタンパク質を見い出した。また、GSTフュージョン・タンパク質を用いてPull-toun assayを行ったところ、前兆のゲルゾリンおよびN末端約半分G1-3に結合する分子量約210kDaのタンパク質を見い出した。今年度は、ゲルゾリンのN末端約半分G1-3のGSTフュージョン・タンパク質をプローブに用いた、G1-3に特異的に結合するp72タンパク質のcDNAクローニング、および全長のゲルゾリンGSTフュージョン・タンパク質を用いたアフィニティークロマトグラフィーによるp210タンパク質の精製、アミノ酸配列決定、およびcDNAクローニングを試みたが、ライブラリー・スクリーニングの際、予想外の非特異的結合のため最終目標には至らなっかた。一方、我々の研究室で、Fas刺激をはじめとする様々な細胞死のシグナルによるヒトT細胞白血病細胞株Jurkanのアポトーシスをゲルゾリンが抑制すること見い出し、また、独立にハーバード大学医学部の研究室から、ゲルゾリンがアポトーシスの際の細胞形態変化において重要な役割を担っているという報告がなされた。これまで、アクチン調節タンパク質として解析されてきたゲルゾリンがアポトーシスという普遍的な生物学的現象と密接に関わることが明らかになり、これらの分子機構解明が早急な研究課題として非常に重要であると考えられた。さらに、アポトーシスの実行に非常に重要な役割をはたしているCaspase 3の基質をyeast two-hybrid systemで検索している中で、ゲルゾリンがCaspase 3の結合タンパク質として単離された。したがって、ゲルゾリンはCaspaseが関わるアポトーシス実行のカスケード上に位置する重要な因子の一つであると考えられた。これらの結果を踏まえた上で、現在、ゲルゾリンがアポトーシスにおいて重要な役割を担っているミトコンドリアにも一部存在することを明らかにしており、今後、ゲルゾリンのミトコンドリアでの機能解析やゲルゾリンに相互作用するタンパク質をさらに検索して、アポトーシスや細胞運動における分子機構について解析していく予定である。

在去年的一项研究中，大约一半的N末端G1-3和大约一半的Gelsolin的C-末端G4-6 cDNA与GST标签中的大肠杆菌中的表达载体整合在一起，并使用谷胱甘肽色谱柱通过亲和色谱法纯化。使用这些融合蛋白作为探针，通过FAC-Western印迹分析了小鼠成纤维细胞NIH/3T3的细胞提取物，在分析时，发现该蛋白特异性结合到大约72 kDa的分子量的G1-3的一半G1-3的蛋白质。此外，当使用GST融合蛋白进行pla刺测定时，我们发现一种蛋白质的分子量约为210 kDa，与前体凝胶素结合，大约一半的N末端G1-3。 This year, we attempted cDNA cloning of the p72 protein that specifically binds to G1-3 using a GST fusion protein of approximately half of G1-3 N-terminus G1-3 as a probe, and purification, amino acid sequencing, and cDNA cloning of the p210 protein by affinity chromatography using the full-length GST fusion protein, but during library screening, we were unable to reach the end goal due to unexpected非特异性结合。同时，在我们的实验室中，我们发现，由于包括FAS刺激在内的各种细胞死亡信号，凝胶素抑制人类T细胞白血病细胞系Jurkan的凋亡，并且独立地报道了凝胶素在细胞凋亡过程中的细胞形态变化中起重要作用。已经揭示了已被分析为肌动蛋白调节蛋白的凝胶素与凋亡的普遍生物学现象密切相关，并且人们认为阐明这些分子机制是一个紧迫的研究主题非常重要。此外，在搜索酵母两杂交系统中caspase 3底物的搜索过程中，凝胶素被分离为胱天蛋白酶3结合蛋白，这在实施凋亡中起着非常重要的作用。因此，凝胶素被认为是涉及胱天蛋白酶的凋亡实践的重要因素之一。考虑到这些结果，已经表明，线粒体存在于目前在凋亡中起重要作用的线粒体，将来我们计划分析线粒体中凝胶蛋白的功能分析，并进一步搜索与凝胶蛋白相互作用的蛋白质，并分析与凝胶蛋白相互作用的蛋白质，并在细胞和细胞运动中分析分子机制。