アクチン調節タンパク質ゲルソリンと相互作用する細胞内情報伝達因子のクローニング

与肌动蛋白调节蛋白凝溶胶蛋白相互作用的细胞内信号因子的克隆

基本信息

批准号：
12034201
负责人：
藤田寿一
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12034201/
关键词：
ゲルソリン Yeast two-hybrid GFP融合タンパク質

项目摘要

細胞運動はアクチンの重合-脱重合による細胞骨格のダイナミックな変動に規定されている。ゲルソリンは、アクチン線維の切断およびその末端の保護、また、重合核形成によるアクチン線維伸長の促進という3つのアクチン重合調節機能を持つ。これらの厳密に調節された両面性の機能を通じてゲルソリンは重合-脱重合という両局面を制御して、細胞運動において重要な役割を担っている。ゲルソリンと相互作用するタンパク質を同定し、解析することで、アクチン細胞骨格再構築の情報伝達系に関与する因子群を見い出し、その分子機構を解明し得ると考えた。ゲルソリンのN末端半分のG1-3、あるいはC末端約100アミノ酸残基を欠失した変異体(C-del)はCa2+イオン非依存性にアクチン線維を切断する。発光オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質GFP(Green Fluorescence Protein)との融合タンパク質としてCos7細胞で発現したところ、細胞死が起こった。酵母細胞において、Ca2+イオン非依存性欠失変異体が同様にアクチン線維を切断するならば、Cos7細胞と同様に致死性になると考え、この性質を利用し酵母の生存を指標にする、強力な選別システムを構築し、全タンパク質の数%を占めるアクチンを除外し、かつゲルソリンに相互作用する因子のcDNAを効率良く得ることが可能であると考えた。Two-hybrid systemで用いられるLex AのDNA結合領域を有し、その発現が、ガラクトース添加により誘導可能な発現ベクター(pGlida)に、ゲルソリン欠失変異体cDNAを組み込んで、選別用酵母細胞株(EGY48)に導入した。これらのゲルソリン欠失変異体の発現が酵母に対して致死性であるかどうかを、ランダムに選別した3クローンをガラクトース存在下で培養し検討したところ、予想に反し、酵母細胞は増殖可能であった。LexAには核内移行シグナルがあるため、核内に欠失変異体が蓄積したことで細胞死が起こらなかった可能性を考え、先と同様の誘導可能な発現ベクター(pKO10)にゲルソリン欠失変異体cDNAを組み込み、酵母の増殖検討後、マウス脳cDNAライブラリーを導入して、ゲルソリン結合因子をスクリーニングした。しかし、候補クローンの塩基配列決定した結果、十分な長さのアミノ酸配列を規定する確実な陽性クローンは、現在までのところ得られてない。また、平行して、ゲルソリンのアクチン結合領域をを除去したいくつかのセグメントをBaitに用いて、通常のTwo-hybrid screen-ingを試みたが、先と同様、現時点では確実な陽性クローンが得られていない。

细胞运动是由肌动蛋白聚合 - 脱聚合引起的细胞骨架的动态变化来定义的。凝胶素具有调节肌动蛋白聚合的三种功能：裂解肌动蛋白纤维并保护其末端，并通过聚合成核促进肌动蛋白纤维延伸。通过这些严格调节的双侧功能，凝胶素控制聚合 - 脱聚合的两个方面，并在细胞运动中起重要作用。通过鉴定和分析与凝胶素相互作用的蛋白质，我们认为可以发现肌动蛋白细胞骨架重建的一组因素，并且可以阐明这些因素的分子机制。在凝胶素的N末端一半中删除了G1-3的突变体（C-DEL），或以Ca2+离子独立的方式在C末端（C-DEL）切割肌动蛋白纤维处的大约100个氨基酸残基。细胞死亡发生在COS7细胞中以融合蛋白为荧光蛋白GFP（绿色荧光蛋白）中的融合蛋白，该细胞死亡发生，该蛋白来自发光的水母。我们认为，如果Ca2+非离子依赖性缺失突变体类似地裂解肌动蛋白纤维，它们会像COS7细胞中一样致命，我们认为，我们认为使用该特性的强大选择系统将酵母菌作为指示剂的存活，排除肌动蛋白，排除蛋白质的蛋白质的数量数百分之几，可以与cDNA相互作用，并且可以获得cdna of Geelslies copity效率。将凝胶素缺失突变体cDNA掺入了两杂交系统中使用的LEX A的DNA结合区域中，并将其表达掺入可以通过半乳糖添加诱导的表达载体（PGLIDA），并将其引入到分类酵母细胞系（EGY48）中。当在半乳糖的存在下培养三个随机选择的克隆以确定这些凝胶素缺失突变体的表达是否对酵母菌致死时，酵母细胞能够生长，这与预期相反。由于Lexa具有核转运信号，因此认为可能由于细胞核中缺失突变体的积累而不会发生细胞死亡，并且在研究了酵母菌生长后，将小鼠脑cDNA纳入了相同的诱导表达载体（PKO10），并且在检查了酵母菌生长后，检查了小鼠脑cDNA库以筛选出凝胶素粘液素的粘液蛋白结合因子。然而，由于候选克隆的测序，迄今为止尚未获得可靠的阳性克隆，可以定义足够长的氨基酸序列。此外，同时，我们尝试使用几个段去除去诱饵中凝胶素的肌动蛋白结合区域的几个片段，但与以前一样，目前尚无可靠的阳性克隆。