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アクチン調節タンパク質ゲルソリンと相互作用する細胞内情報伝達因子のクローニング

与肌动蛋白调节蛋白凝溶胶蛋白相互作用的细胞内信号因子的克隆

基本信息

批准号：
12034201
负责人：
藤田寿一
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12034201/
关键词：
ゲルソリン Yeast two-hybrid GFP融合タンパク質

项目摘要

細胞運動はアクチンの重合-脱重合による細胞骨格のダイナミックな変動に規定されている。ゲルソリンは、アクチン線維の切断およびその末端の保護、また、重合核形成によるアクチン線維伸長の促進という3つのアクチン重合調節機能を持つ。これらの厳密に調節された両面性の機能を通じてゲルソリンは重合-脱重合という両局面を制御して、細胞運動において重要な役割を担っている。ゲルソリンと相互作用するタンパク質を同定し、解析することで、アクチン細胞骨格再構築の情報伝達系に関与する因子群を見い出し、その分子機構を解明し得ると考えた。ゲルソリンのN末端半分のG1-3、あるいはC末端約100アミノ酸残基を欠失した変異体(C-del)はCa2+イオン非依存性にアクチン線維を切断する。発光オワンクラゲ由来の蛍光タンパク質GFP(Green Fluorescence Protein)との融合タンパク質としてCos7細胞で発現したところ、細胞死が起こった。酵母細胞において、Ca2+イオン非依存性欠失変異体が同様にアクチン線維を切断するならば、Cos7細胞と同様に致死性になると考え、この性質を利用し酵母の生存を指標にする、強力な選別システムを構築し、全タンパク質の数%を占めるアクチンを除外し、かつゲルソリンに相互作用する因子のcDNAを効率良く得ることが可能であると考えた。Two-hybrid systemで用いられるLex AのDNA結合領域を有し、その発現が、ガラクトース添加により誘導可能な発現ベクター(pGlida)に、ゲルソリン欠失変異体cDNAを組み込んで、選別用酵母細胞株(EGY48)に導入した。これらのゲルソリン欠失変異体の発現が酵母に対して致死性であるかどうかを、ランダムに選別した3クローンをガラクトース存在下で培養し検討したところ、予想に反し、酵母細胞は増殖可能であった。LexAには核内移行シグナルがあるため、核内に欠失変異体が蓄積したことで細胞死が起こらなかった可能性を考え、先と同様の誘導可能な発現ベクター(pKO10)にゲルソリン欠失変異体cDNAを組み込み、酵母の増殖検討後、マウス脳cDNAライブラリーを導入して、ゲルソリン結合因子をスクリーニングした。しかし、候補クローンの塩基配列決定した結果、十分な長さのアミノ酸配列を規定する確実な陽性クローンは、現在までのところ得られてない。また、平行して、ゲルソリンのアクチン結合領域をを除去したいくつかのセグメントをBaitに用いて、通常のTwo-hybrid screen-ingを試みたが、先と同様、現時点では確実な陽性クローンが得られていない。

The regulation of cell movement in cell skeleton is based on the coincidence and disengagement of cell movement. The protection of the end of the line, the protection of the end of the line, the promotion of the extension of the line, the formation of the overlap core, and the adjustment of the overlap core are maintained. The function of this close regulation is to control the situation of coincidence and disconnection, and to control the important function of cell movement A study on the relationship between the molecular structure and the information system of cellular bone reconstruction The N-terminal half of the protein is G1-3, and the C-terminal half is about 100 amino acid residues. The C-del is Ca2 +-independent. Green Fluorescence Protein (GFP) and Fusion Protein (GFP) were developed in Cos7 cells, and cell death was initiated. In yeast cells, Ca2 +-independent variants are the same as those that cut off the connective thread, and Cos7 cells are the same as those that are lethal. This property can be used as an indicator of yeast survival, and a powerful selection system is built that accounts for several % of the total quality of yeast, except for cookies, The cDNA of the interaction factor is very effective. Two-hybrid system is used to introduce Lex A DNA binding domain, discovery, addition, induction, possible discovery (pGlida), deletion, and heterologous cDNA into yeast cell line for selection (EGY48). In the presence of these factors, yeast cells may be cultured in the presence of a variety of enzymes, such as yeast cells, yeast cells, and yeast cells. LexA is a gene that can be induced by the same gene. LexA is a gene that can be induced by the same gene. LexA is a gene that can be induced by the same gene. LexA is a gene that can be induced by the same gene. The result of the determination of the base arrangement of the candidate list is that the positive list is correct and the negative list is correct. In general, Two-hybrid screen-ing is used to test the opposite, first and second, and the current point is to ensure that the positive and negative signals are obtained.