ゲルゾリンの機能抑制変異体を用いた細胞運動分子機構の解明

使用功能抑制的凝溶胶蛋白突变体阐明细胞运动的分子机制

• 批准号: 07857011
• 负责人: 藤田 寿一
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07857011/
• 关键词: ゲルゾリン; セバリング活性; 機能抑制変異体; 細胞運動制御

1)ゲルゾリンの機能欠失変異体の作製および発現ゲルゾリンのseveringに関与するG1ドメインを欠いたG2-6,G2-3およびG4-6変異体ならびにカルシウムイオンによる活性制御領域を欠失したC-del645変異体をPCRにより作製した。これらの変異体を大腸菌の系において発現し、精製した。2)ゲルゾリンの機能欠失変異体の生化学的解析精製したG2-6,G2-3およびG4-6各変異体においてsevering活性が消失していることをピレンでラベルした精製アクチンを用いてin vitroの系で確認した。またC-del645変異体では、その活性発現においてカルシウムイオン非依存性であることを確認した。次に、G2-6,G2-3およびG4-6各変異体が野性型ゲルゾリンのsevering活性におよぼす影響をin vitroの系で検討した。その結果、G2-6変異体がsevering活性が強く抑制することが明らかになった。さらに、そのsevering抑制活性は、カルシウムイオンを必要とした。3)ゲルゾリンsevering能抑制変異体G2-6の細胞株への導入in vitroの系において野性型ゲルゾリンのsevering活性を抑制するG2-6変異体cDNAをマウスのメラノーマ細胞株であるB16BL6にリポフェクション法により導入した。ハイグロマイシンBによる選択後、生存してきたクローンからゲノムDNAを抽出し、PCRによりG2-6変異体cDNAの導入を確認した。さらに、G2-6変異体cDNA導入クローンからタンパク質を抽出し、抗ゲルゾリン抗体を用いてウエスタン・ブロット法により、G2-6変異体の発現を調べたところ、G2-6変異体cDNAは導入されているにも関わらず、すべてのクローンでその発現は認められなかった。RT-PCRによりmRNAの発現を検討したところ、G2-6変異体cDNA由来のmRNAは検出不能であった。次に、in vitro transcription-translation法により解析した結果、G2-6変異体cDNAはin vitroにおいては翻訳されることが明らかになった。以上の結果から、G2-6変異体の発現は、細胞の生存に対して、何らかの抑制的な作用をおよぼすことが推測された。今後、誘導可能な発現システムを用いることでG2-6変異体の細胞運動に対する影響を検討していく予定である。

1）创建凝胶素和表达功能功能突变体的缺失。 PCR产生了缺乏与凝胶素切断的G1域的G2-6，G2-3和G4-6突变体，以及缺乏切断凝胶素的G1结构域，以及通过钙离子损失的C-DEL645突变体，由PCR产生。这些突变体在大肠杆菌系统中表达并纯化。 2）使用纯化的pyrene标记的肌动蛋白在体外证实了纯化G2-6，G2-3和G4-6突变体在纯化的G2-6，G2-3和G4-6突变体中的生化分析。此外，已经证实，C-DEL645突变体在其活性表达中不依赖钙离子。接下来，在体外系统中研究了G2-6，G2-3和G4-6突变体对野生型凝胶素活性的明显活性的影响。结果，发现G2-6突变体强烈抑制了断开活性。此外，其切断的抑制活性需要钙离子。 3）将凝胶素切断的突变体G2-6引入体外系统中的细胞系中，将抑制野生凝胶素的切断活性的G2-6突变体cDNA引入了B16BL6，这是B16BL6，这是一种通过脂肪输出的小鼠的黑色素瘤细胞系。选择湿霉素B后，从存活的克隆中提取基因组DNA，PCR证实了G2-6突变cDNA的引入。此外，从引入G2-6突变体cDNA的克隆中提取蛋白质，并使用抗凝血素抗体通过蛋白质印迹检查G2-6突变体的表达。即使引入了G2-6突变cDNA，但在所有克隆中都没有观察到其表达。当通过RT-PCR检查mRNA表达时，无法检测到源自G2-6突变cDNA的mRNA。接下来，通过体外转录 - 翻译方法分析表明，G2-6突变cDNA在体外翻译。从上述结果中可以推测出G2-6突变体的表达对细胞存活具有一定的抑制作用。将来，我们计划通过使用诱导表达系统来研究G2-6突变体对细胞运动的影响。