ゲルゾリンの機能抑制変異体を用いた細胞運動分子機構の解明

使用功能抑制的凝溶胶蛋白突变体阐明细胞运动的分子机制

• 批准号: 07857011
• 负责人: 藤田 寿一
• 金额: $ 0.58万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07857011/
• 关键词: ゲルゾリン; セバリング活性; 機能抑制変異体; 細胞運動制御

1)ゲルゾリンの機能欠失変異体の作製および発現ゲルゾリンのseveringに関与するG1ドメインを欠いたG2-6,G2-3およびG4-6変異体ならびにカルシウムイオンによる活性制御領域を欠失したC-del645変異体をPCRにより作製した。これらの変異体を大腸菌の系において発現し、精製した。2)ゲルゾリンの機能欠失変異体の生化学的解析精製したG2-6,G2-3およびG4-6各変異体においてsevering活性が消失していることをピレンでラベルした精製アクチンを用いてin vitroの系で確認した。またC-del645変異体では、その活性発現においてカルシウムイオン非依存性であることを確認した。次に、G2-6,G2-3およびG4-6各変異体が野性型ゲルゾリンのsevering活性におよぼす影響をin vitroの系で検討した。その結果、G2-6変異体がsevering活性が強く抑制することが明らかになった。さらに、そのsevering抑制活性は、カルシウムイオンを必要とした。3)ゲルゾリンsevering能抑制変異体G2-6の細胞株への導入in vitroの系において野性型ゲルゾリンのsevering活性を抑制するG2-6変異体cDNAをマウスのメラノーマ細胞株であるB16BL6にリポフェクション法により導入した。ハイグロマイシンBによる選択後、生存してきたクローンからゲノムDNAを抽出し、PCRによりG2-6変異体cDNAの導入を確認した。さらに、G2-6変異体cDNA導入クローンからタンパク質を抽出し、抗ゲルゾリン抗体を用いてウエスタン・ブロット法により、G2-6変異体の発現を調べたところ、G2-6変異体cDNAは導入されているにも関わらず、すべてのクローンでその発現は認められなかった。RT-PCRによりmRNAの発現を検討したところ、G2-6変異体cDNA由来のmRNAは検出不能であった。次に、in vitro transcription-translation法により解析した結果、G2-6変異体cDNAはin vitroにおいては翻訳されることが明らかになった。以上の結果から、G2-6変異体の発現は、細胞の生存に対して、何らかの抑制的な作用をおよぼすことが推測された。今後、誘導可能な発現システムを用いることでG2-6変異体の細胞運動に対する影響を検討していく予定である。

1) G1, G2-6,G2-3, G4-6, G1, G2-6, G3 - 6, G4-6, G4-6, G4 The system of foreign coliform bacteria was developed and refined. 2) The biochemical analysis and purification of the functional variant of G2-6,G2-3 and G4-6 were confirmed. C-del645 is a variant of the active species. G2-6,G2-3, and G4-6 are among the most diverse species in the world. As a result, G2-6 variant severing activity was strongly inhibited. It is necessary to prevent severing activity. 3) The gene severing can inhibit the gene severing activity of G2 - 6 gene in vitro and B16BL6 gene severing activity in vitro. After selection, DNA extraction and PCR confirmation of G2-6 variant cDNA In addition, the G2-6 variant cDNA was introduced into the genome, extracted from the genome, and anti-G2 - 6 variant antibody was used to modulate the expression of the G2 -6 variant cDNA. RT-PCR detection of mRNA and G2-6 mRNA G2-6 foreign cDNA in vitro The above results indicate that G2-6 gene expression is related to cell survival, and that the inhibition of G2 - 6 gene expression is related to cell survival. In the future, induction may occur in the cell movement of G2-6 allogeneic cells.