Ku80タンパク質のLeu-Ser繰り返し構造の放射線感受性における役割

Ku80蛋白Leu-Ser重复结构在放射敏感性中的作用

• 批准号: 08771637
• 负责人: 三浦 雅彦
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: Tokyo Medical and Dental University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08771637/
• 关键词: DNA二重鎖切断; DNA修復; Ku80; 部位特異的変異導入法

本研究の目的は、放射線感受性を決定する重要な機構と考えられるDNA二重鎖切断修復に必須の因子であるKu80タンパク質に人工的に変異を加え、その変異タンパク質が放射線感受性に影響を与えるかを調べることによって、Ku80タンパク質の機能解析を行なうことである。ターゲットは、その配列上、Ku70とダイマーを形成すると予想されているロイシン-セリン繰り返し構造部とした。ヒトKu80cDNAは、慶応大三森博士より供与頂き、発現させるための細胞(Ku80遺伝子を欠損するxrs-5)は、英国Sussex大学Dr.Jeggoより供与頂いた。ヒトKu80cDNAを含むplasmidを鋳型として、PCRによって5'側756bpを増幅し(3'側にEcoRV部位を含む)、これをTAクローニングベクターで発現ベクターでもあるpCR3(lnvitrogen)にサブクローニングした。sense方向に挿入されたプラスミドを選択し、EcoRV、Xholで消化した後、ベクターを含む断片を精製し、Ku80cDNA3′側coRV-Xhol断片をligateして全長Ku80cDNAを含む発現plasmidを得た。(pCR3Ku80)。最初のメチオニンから数えて、6番目と7番目のメチオニンの間に繰り返し構造が存在するので、それぞれのメチオニンから翻訳が開始するように、PCR-assisted in vitro mutagenesisによって、2つの変異plasmidを作製した(pCR6Met ,pCR7Met)。野性型、変異型plasmidをxrs-5細胞にリポソーム法によってtransfectionし、G418によって選択を行なって多くのクローンを得たものの、ヒトKu80タンパクはWestern blotによってほとんど発現が認められなかった。そこで、発現ベクターをpBKRSVに組み換え、実験を繰り返したところ、6Metを発現するクローンが1つだけ得られたが、発現量は不十分であった。従って,現在までのところまだ結論は得られていないが、今後技術的問題を克服して目的を達成したいと考えている。

The purpose of this study is to investigate the important mechanisms for determining radiosensitivity and the factors necessary for DNA double-lock repair. The structure of the structure The Ku80 cDNA was developed by Dr. Jeggo of Sussex University. Ku80 cDNA contains a plasmid, DNA type, PCR amplification of 756bp on the 5'side (EcoRV position on the 3'side), and DNA sequencing of pCR3(lnvitrogen). sense orientation, EcoRV, Xhol, digestion, purification, Ku80 cDNA3′-coRV-Xhol fragment, ligate, full-length Ku80 cDNA, plasmid (pCR3Ku80)。The initial mutation number, the 6-and 7-point mutation number, the 6-point mutation number, the 7-point mutation number, the 2-and 2-point mutation number (pCR6Met ,pCR7Met). Wild type, variant plasmid XRS-5 cell sorting method, G418 cell sorting method, Ku80 cell sorting method, Ku80 cell sorting method For example, if you want to change your password, you can change your password. If you want to change your password, you can change your password. In the future, technical problems will be overcome and goals will be achieved.