変異酵素を用いた脂肪酸β酸化酵素複合体の機能領域の解明

使用突变酶阐明脂肪酸 β-氧化酶复合物的功能区域

• 批准号: 08780578
• 负责人: 木原 昌子
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-08780578/
• 关键词: 脂肪酸; β酸化; 変異導入; 多機能酵素

細菌,あるいは,動物のミトコンドリアやペルオキシソーム,また植物におけるグリオキシソームのβ酸化系には,エノイル-CoAヒドラターゼ,ヒドロキシルアシル-CoAデヒドロゲナーゼ,およびケトアシル-CoAチオラーゼ活性を持つ多機能酵素が存在している.本研究は,複数の触媒活性を持つ本酵素タンパク質の機能領域に注目し,基質である脂肪酸の分子認識機構,および,それぞれの反応の触媒機構を分子レベルで明らかにするために,α_2β_2のサブユニット構造を持つ大腸菌酵素を用いて,以下のように研究を進めた.まず,本酵素遺伝子の発現プラスミドpBF100構築し,そのαサブユニット遺伝子に,PCRを用いてランダムに変異導入した.このプラスミドを本酵素遺伝子の欠損株LS6749に導入して,約10^4個のコロニーからオレイン酸を単一の炭素源とする最小倍地で生育が遅くなった株を選択した.それらのαサブユニット遺伝子の塩基配列を決定したところ,Gly-67→Ser,Arg-134→Gly,Ser-151→Pro,Lys-212→Glu,Pro-383→Leu,Val-418→Ala,Val-615→Ala,Glu-625→Lys,Val-318→Glu/Val-640→Glu,Leu-270→end,Leu-55→frameshift (84→end) の変異酵素遺伝子が得られた。それぞれの変異酵素遺伝子を持つ大腸菌の細胞抽出液において,各サブユニットの量を免疫抗体法により調べたことろ,Lys-212,Val-418,Val-318 and/or Val-640残基は,α/βサブユニット間の相互作用に重要であることが示唆された.次に,本酵素と他の種由来の多機能あるいは単機能のβ酸化酵素との一時構造を比較して,保存性の高い領域の親水性アミノ酸5残基に部位特異的に変異を導入した.変異酵素の活性が低下したことから,アミノ末端領域のGlu-139残基,よびカルボキシル末端領域のMet-324,Glu-462,Lys-486残基は触媒活性に重要であることが示唆された。

In bacteria, there is a wide variety of animal species, including plants, plants and beta-acid systems, and the presence of multi-functional enzymes. In this study, we focused on the functional domain of multiple catalytic activity of the enzyme, the molecular recognition mechanism of fatty acids, the molecular recognition mechanism of α_2β_2 and the molecular recognition mechanism of fatty acids. In addition, the enzyme gene was developed by pBF100 construction, and PCR was used to construct the pBF100 gene. The enzyme gene was introduced into the defective strain LS6749, and about 10^4 cells were selected from the plant with the smallest number of cells. Ala, Val-615→Ala, Glu-625→Lys,Val-318→Glu/Val-640→ Glu,Leu-270→end,Leu-55→frameshift (84→end). In the cell extract of Escherichia coli, the amount of each enzyme is determined by immunoantibody method. Lys-212,Val-418,Val-318 and/or Val-640 residues are important for the interaction between α/β residues. In addition, the enzyme and other species of multifunctional origin, in the middle of the functional beta acidifying enzyme and temporal structure comparison, preservation and high in the field of hydrophilic acid 5 residues site-specific differences introduced. The Glu-139 residue in the terminal domain, Met-324,Glu-462,Lys-486 residue in the terminal domain are important for catalytic activity.

项目成果

Kunio Takeyasu: "Molecular imaging of Escherichia coli FOF1-ATPase in...." FEBS Lett.392. 110-113 (1996)

Kunio Takeyasu：“大肠杆菌 FOF1-ATP 酶的分子成像……”FEBS Lett.392。