DNA複製開始に必須なndalおよびnda4遺伝子の作用機構の解析

ライセンス因子が関与する制御系により、DNA複製が1細胞周期にあたり限定される。本研究は、ライセンス因子の候補であるMCMファミリーに属する分裂酵母ndal、nda4産物及びnda4サプレッサー遺伝子sna41産物の、DNA複製時における機能を明らかとする事を目的とする。nda4産物の機能を明らかにするため、nda4サプレッサー変異株sna41(suppressor of nda4)を単離した。sna41変異株を制限温度で培養しフローサイトメトリーを行った結果、1CのDNA含量の細胞が増加したことから、sna41遺伝子はDNA複製に関与することが示された。sna41産物の局在を調べるため、染色体上の自分自身のプロモーターの下流に、C端末にFLAGをつけたsna41産物をコードする遺伝子をつないだ株を作製し、抗FLAG抗体を用いて蛍光抗体法を行ったが、シグナルは観察されなかった。このことから、この遺伝子産物は、微量しか存在しないことが示唆された。分裂酵母細胞内で誘導可能なプロモーターを用い、sna41-FLAG産物が大量に発現した同調していない株を用いて同様の実験を行ったところ、一部の細胞で核に局在が認められた。これにより、sna41産物は、細胞周期のある時期には核に局在する可能性が示された。さらに、細胞周期の各時期でのsna41産物の局在を調べるため、細胞分裂周期突然変異株cdc25あるいはcdc10細胞内でsna41-FLAG産物を大量発現し、その局在を調べた。G1期で停止したcdc10変異株では、30-40%の細胞でsna41産物の局在が核に認められたが、G2期で停止したcdc25変異株では、10-20%の細胞のみに核にsna41産物が検出され、また、そのシグナルもcdc10変異株のシグナルより弱かった。このことから、細胞周期におけるsna41産物の局在が異なることが示唆される。

ライセンス因子が関与する制御系により、DNA複製が1細胞周期にあたり限定される。本研究は、ライセンス因子の候補であるMCMファミリーに属する分裂酵母ndal、nda4産物及びnda4サプレッサー遺伝子sna41産物の、DNA複製時における機能を明らかとする事を目的とする。nda4産物の機能を明らかにするため、nda4サプレッサー変異株sna41(suppressor of nda4)を単離した。sna41変異株を制限温度で培養しフローサイトメトリーを行った結果、1CのDNA含量の細胞が増加したことから、sna41遺伝子はDNA複製に関与することが示された。sna41産物の局在を調べるため、染色体上の自分自身のプロモーターの下流に、C端末にFLAGをつけたsna41産物をコードする遺伝子をつないだ株を作製し、抗FLAG抗体を用いて蛍光抗体法を行ったが、シグナルは観察されなかった。このことから、この遺伝子産物は、微量しか存在しないことが示唆された。分裂酵母細胞内で誘導可能なプロモーターを用い、sna41-FLAG産物が大量に発現した同調していない株を用いて同様の実験を行ったところ、一部の細胞で核に局在が認められた。これにより、sna41産物は、細胞周期のある時期には核に局在する可能性が示された。さらに、細胞周期の各時期でのsna41産物の局在を調べるため、細胞分裂周期突然変異株cdc25あるいはcdc10細胞内でsna41-FLAG産物を大量発現し、その局在を調べた。G1期で停止したcdc10変異株では、30-40%の細胞でsna41産物の局在が核に認められたが、G2期で停止したcdc25変異株では、10-20%の細胞のみに核にsna41産物が検出され、また、そのシグナルもcdc10変異株のシグナルより弱かった。このことから、細胞周期におけるsna41産物の局在が異なることが示唆される。