DNA複製開始に不可欠なnda1およびnda4遺伝子の作用機構の解析

DNA复制起始必需的nda1和nda4基因的作用机制分析

• 批准号: 07254211
• 负责人: 三宅 早苗
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Toho University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07254211/
• 关键词: 細胞周期; DNA複製; MCM; nda; ライセンス因子

DNA複製に関与する遺伝子として、種々の生物種からMCM遺伝子が単離されている。研究代表者らは、分裂酵母及びアフリカツメガエルを用いて、MCMファミリーに属するnda1及びnda4遺伝子の機能解析を行っている。nda4遺伝子の機能を調べるため、分裂酵母において、nda4変異株のサプレッサーを単離した。サプレッサー変異株は高温感受性であり、高温で培養すると細胞が伸長するという表現型を示す。サプレッサー遺伝子は生育に必須であり、既知の蛋白質とは相同性のない約70kDの蛋白質をコードしていた。サプレッサー遺伝子産物に対する抗体を作製し、nda4産物と結合しているかを免疫沈降法により調べたが、nda4産物とは共沈しなかった。また、C末端にFLAGをつけたサプレッサー遺伝子産物を分裂酵母細胞内で大量に発現させ、FLAGに対する抗体を用いて蛍光抗体法を行った。同調していない細胞では、一部の細胞で核に局在が認められた。細胞周期により局在が変化する可能性も考えられるので、現在、詳細な解析を行っている。また、アフリカツメガエルから2種のnda類似遺伝子xMCM2及びxCDC46を単離した。これらの遺伝子産物に対する抗体を作製し、ウエスタンプロット法を行った結果、xMCM2産物では120kDの、xCDC46産物では95kDの大きさの蛋白質が検出された。これらの分子量は予想より大きな値だが、これは他のMCM蛋白質でもみられ、MCMファミリーの特徴と思われる。免疫沈降を行ったところ、どちらの抗体を用いても、もう一方の産物が共沈してくることから、xMCM2産物とxCDC46産物は互いに結合していることが示された。また、精子核を鋳型としたアフリカツメガエル卵抽出液を用いたin vitro DNA複製系において、DNA複製にともなうこれらの遺伝子産物の局在の変化を調べた。xMCM2産物およびxCDC46産物は、DNA複製に先だち精子核に局在が認められたが、複製終了後、認められなくなった。これにより、この遺伝子産物は、DNA複製開始に関与することが示唆された。

DNA replication is related to する伝子として, species 々のbiotic species からMCM 缝子が単利されている. Representatives of research include らは, fission yeast and びアフリカツメガエルをいて, MCMフFunctional analysis of the ァミリーに genus するnda1 and びnda4 伝子を行っている. nda4 缝子のfunctional を Adjustment べるため, fission yeast において, nda4変different strain のサプレッサーを単leave した. The high-temperature sensitivity of the different strains of the サプレッサー変 strain and the high-temperature culture of the cells and the elongation of the cells are shown in the phenotype.サプレッサー人伝子は生に必であり, known のprotein とはidentity のないabout 70kD のprotein をコードしていた. The サプレッサーchild product に対するantibodies are produced and the nda4 products are combined.いるかをimmunosedimentation method により べたが, nda4 product とは co-precipitation しなかった. The C-terminal FLAG antibody was detected in large amounts in fission yeast cells using the photoantibody method. The same tone is the same as the cell, and the core of the cell is the same as the cell. The possibility of changing the cell cycle in the cell cycle is now analyzed in detail. The 2 kinds of また and アフリカツメガエルから are similar to the 缝子xMCM2 and びxCDC46 を単里した.これらの缝子product に対するAntibodiesをManufactureし、ウエスタンプロット法を行った results、xMCM The 2 product is 120kD, and the xCDC46 product is 95kD large protein.これらの molecular weight は yu want より大きな値だが, これはhis のMCM protein でもみられ, MCM ファミリーの特徴と思われる. Immunoprecipitation を row ったところ, どちらのantibody を いても, もう Party のproduct が co-precipitation してくることから、xMCM2 product and xCDC46 product are combined with each other and していることがshows された.また、Sperm nucleus を鋳 type としたアフリカツメガエル egg extraction liquid を use いた in vitro DNA複製系において、DNA複製にともなうこれらの遺伝子産物の局在の変化を調べた。 xMCM2 product およびxCDC46 product は, DNA replication first だち sperm nucleus に が cognition めら れ た が, after replication is completed, められ なくなった.これにより、この缝子product は、DNA replication starts and することが说円された.

项目成果

Miyake S. et al: "Efficient generation of recombinant adenovirus using adonovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93. 1320-1324 (1996)

Miyake S. 等人：“使用腺病毒 DNA 末端蛋白复合物和带有全长病毒基因组的粘粒高效生成重组腺病毒。”

Tsukui T. et al: "Gene transfer and expression in mouse preimplantation embryos by recombinant adenovirus vector." Mol. Reprod. Dev.42. 291-297 (1995)

Tsukui T. 等人：“通过重组腺病毒载体在小鼠植入前胚胎中进行基因转移和表达。”

Makimura M. et al: "Induction of antibodies against structural proteins of hepatitis C virus in mice using recombinant adenovirus." Vaccine. 14. 28-34 (1996)

Makimura M. 等人：“使用重组腺病毒在小鼠体内诱导抗丙型肝炎病毒结构蛋白的抗体。”

Kimura K. et al: "Phosphatidylinositol-3 kinase in fission yeast: a possible role in stress responses" Biosci. Biotech. Biochem.59. 678-682 (1995)

Kimura K. 等人：“裂殖酵母中的磷脂酰肌醇 3 激酶：在应激反应中的可能作用”Biosci。

Miyake S. et al: "Identification of two Xenopus laevis genes, xMCM2 and xCDC46,with sequence homology to MCM genes involved in DNA replication" Gene. (in press).

Miyake S. 等人：“鉴定了两个非洲爪蟾基因 xMCM2 和 xCDC46，与参与 DNA 复制的 MCM 基因具有序列同源性”基因。