DNA複製開始に不可欠なnda1およびnda4遺伝子の作用機構の解析

DNA複製に関与する遺伝子として、種々の生物種からMCM遺伝子が単離されている。研究代表者らは、分裂酵母及びアフリカツメガエルを用いて、MCMファミリーに属するnda1及びnda4遺伝子の機能解析を行っている。nda4遺伝子の機能を調べるため、分裂酵母において、nda4変異株のサプレッサーを単離した。サプレッサー変異株は高温感受性であり、高温で培養すると細胞が伸長するという表現型を示す。サプレッサー遺伝子は生育に必須であり、既知の蛋白質とは相同性のない約70kDの蛋白質をコードしていた。サプレッサー遺伝子産物に対する抗体を作製し、nda4産物と結合しているかを免疫沈降法により調べたが、nda4産物とは共沈しなかった。また、C末端にFLAGをつけたサプレッサー遺伝子産物を分裂酵母細胞内で大量に発現させ、FLAGに対する抗体を用いて蛍光抗体法を行った。同調していない細胞では、一部の細胞で核に局在が認められた。細胞周期により局在が変化する可能性も考えられるので、現在、詳細な解析を行っている。また、アフリカツメガエルから2種のnda類似遺伝子xMCM2及びxCDC46を単離した。これらの遺伝子産物に対する抗体を作製し、ウエスタンプロット法を行った結果、xMCM2産物では120kDの、xCDC46産物では95kDの大きさの蛋白質が検出された。これらの分子量は予想より大きな値だが、これは他のMCM蛋白質でもみられ、MCMファミリーの特徴と思われる。免疫沈降を行ったところ、どちらの抗体を用いても、もう一方の産物が共沈してくることから、xMCM2産物とxCDC46産物は互いに結合していることが示された。また、精子核を鋳型としたアフリカツメガエル卵抽出液を用いたin vitro DNA複製系において、DNA複製にともなうこれらの遺伝子産物の局在の変化を調べた。xMCM2産物およびxCDC46産物は、DNA複製に先だち精子核に局在が認められたが、複製終了後、認められなくなった。これにより、この遺伝子産物は、DNA複製開始に関与することが示唆された。

DNA複製に関与する遺伝子として、種々の生物種からMCM遺伝子が単離されている。研究代表者らは、分裂酵母及びアフリカツメガエルを用いて、MCMファミリーに属するnda1及びnda4遺伝子の機能解析を行っている。nda4遺伝子の機能を調べるため、分裂酵母において、nda4変異株のサプレッサーを単離した。サプレッサー変異株は高温感受性であり、高温で培養すると細胞が伸長するという表現型を示す。サプレッサー遺伝子は生育に必須であり、既知の蛋白質とは相同性のない約70kDの蛋白質をコードしていた。サプレッサー遺伝子産物に対する抗体を作製し、nda4産物と結合しているかを免疫沈降法により調べたが、nda4産物とは共沈しなかった。また、C末端にFLAGをつけたサプレッサー遺伝子産物を分裂酵母細胞内で大量に発現させ、FLAGに対する抗体を用いて蛍光抗体法を行った。同調していない細胞では、一部の細胞で核に局在が認められた。細胞周期により局在が変化する可能性も考えられるので、現在、詳細な解析を行っている。また、アフリカツメガエルから2種のnda類似遺伝子xMCM2及びxCDC46を単離した。これらの遺伝子産物に対する抗体を作製し、ウエスタンプロット法を行った結果、xMCM2産物では120kDの、xCDC46産物では95kDの大きさの蛋白質が検出された。これらの分子量は予想より大きな値だが、これは他のMCM蛋白質でもみられ、MCMファミリーの特徴と思われる。免疫沈降を行ったところ、どちらの抗体を用いても、もう一方の産物が共沈してくることから、xMCM2産物とxCDC46産物は互いに結合していることが示された。また、精子核を鋳型としたアフリカツメガエル卵抽出液を用いたin vitro DNA複製系において、DNA複製にともなうこれらの遺伝子産物の局在の変化を調べた。xMCM2産物およびxCDC46産物は、DNA複製に先だち精子核に局在が認められたが、複製終了後、認められなくなった。これにより、この遺伝子産物は、DNA複製開始に関与することが示唆された。