DNA複製制御における核膜の機能の解析

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DNA複製がライセンス因子によって細胞周期あたり1回に限定されるが、この制御系において、核膜がライセンス因子の通過を妨げるという重要な役割を果たしている。本研究では、ライセンス因子の候補であるMCMファミリーに属する分裂酵母nda1、nda4産物及びnda4サプレッサー遺伝子sna41産物が、DNA複製時において、核膜とどの様に関わりながら機能するか、そのメカニズムを明らかとする事を目的とする。nda4産物の機能を明らかにするため、nda4サプレッサー変異株sna41を単離した。フローサイトメトリーの結果、sna41変異株は制限温度下において1CのDNA含量の細胞が増加することから、DNA複製に関与することが示された。sna41産物の局在を調べるため、染色体上の自分自身のプロモーターの下流に、C末端にFLAGをつけたsna41産物をコードする遺伝子をつないだ株を用いて、抗FLAG抗体を用いて蛍光抗体法を行ったが、シグナルは観察されなかった。このことから、この遺伝子産物は、微量しか存在しないことが示唆された。分裂酵母細胞内で誘導可能なプロモーターを、用いて大量に発現し、同様の実験を行ったところ、一部の細胞で核に局在が認められsna41産物は、核膜を通過する事が示された。さらに、細胞周期の各時間でのsna41産物の局在を調べるため、細胞分裂周期突然変異株cdc25あるいはcdc10細胞内でFLAGをつけたsna41産物を発現し、その局在を調べた。G1期で停止したcdc10変異株では、30-40%の細胞でsna41産物の局在が核に認められたが、G2期で停止したcdc25変異株では、10-20%の細胞のみに核にsna41産物が検出され、また、そのシグナルもcdc10変異株のシグナルより弱かった。このことから、細胞周期におけるsna41産物の局在が異なることが示唆される。