DNA複製開始に異常を示すndal及びnda4変異株のサプレッサーの単離と解析

显示 DNA 复制起始缺陷的 ndal 和 nda4 突变体抑制子的分离和分析

• 批准号: 07780634
• 负责人: 三宅 早苗
• 金额: $ 0.64万
• 依托单位: Toho University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07780634/
• 关键词: サプレッサー; 分裂酵母; DNA複製; MCM; nda; ライセンス因子

DNA複製を1細胞周期につき1回に制御する因子として、ライセンス因子が想定されている。近年、様々な生物種からMCM遺伝子が単離され、そのうちの多くは、DNA複製に関与することが示された。研究代表者は、分裂酵母よりMCMファミリーに属する遺伝子ndal及びnda4を単離し、これらの遺伝子の機能解析を行っている。ndal及びnda4変異株のサプレッサーの単離を行った結果、nda4変異株のサプレッサーを13株得た。13株のうち、1株がnda4遺伝子そのものに、残りの12株がnda4以外の同一遺伝子座に変異を生じていた。nda4サプレッサー変異株は高温感受性であり、高温で培養すると細胞が伸長するという表現型を示す。サプレッサー遺伝子は生育に必須であり、既知の蛋白質とは相同性のない約70kDの蛋白質をコードしていた。変異株を非許容温度で培養し、フローサイトメトリーを行った結果、1CのDNA含量を持つ細胞が増加することから、サプレッサー遺伝子はDNA複製に関与することが示された。サプレッサー遺伝子産物をGST融合蛋白質として大腸菌内で大量に発現し、精製し、ウサギに免役し、抗体を作製した。この抗体を用いて、nda4産物と結合しているかを免疫沈降法により調べたが、nda4産物とは共沈しなかった。サプレッサー産物とnda4産物は互いに結合していないことが示唆されるが、ある特殊な条件下でのみ結合する可能性は否定できない。サプレッサー遺伝子産物の局在を調べるため、抗体を精製し蛍光抗体法を行ったが、遺伝子産物は検出されなかった。このことから、サプレッサー遺伝子産物は、少量しか発現していない可能性が示唆された。そこで、C末端にFLAGをつけたサプレッサー遺伝子産物を分裂酵母細胞内で大量に発現させ、FLAGに対する抗体を用いて蛍光抗体法を行った。同調していない細胞では、一部の細胞で核に局在が認められた。細胞周期により局在が変化する可能性も考えられるので、現在、詳細な解析を行っている。

DNA copy 1 cell cycle 1 to control the number of factors, the number of factors is determined. In recent years, many biological species have been isolated from MCM, multiplicated, DNA replicates and sequenced. The representative of the research, the mitotic yeast MCM gene, the sub-ndal and the nda4 sub-machine can be used to analyze the data. Ndal and nda4 strains were isolated from each other, and nda4 strains were isolated from 13 strains. 13 strains, 1 strain of nda4, and 12 strains of remnant were isolated from the same pedestal other than nda4. Nda4 strains were sensitive to high temperature and cultured at high temperature. the cell elongation and cell growth patterns of the strains were detected. It is necessary to give birth to a child. It is known that the protein gene is similar to the 70kD protein gene. The results showed that the content of 1C DNA was higher than that of the control group, and the concentration of DNA in the cell was higher than that in the control group. The GST fusion protein was detected in a large number of bacteria, spermatozoa, antigens, immunity and antibodies. The antibodies were co-precipitated by immunoprecipitation, nda4 and immunoprecipitation. The antibodies were co-precipitated with nda4. The possibility of combining nda4 materials with each other is negative under special conditions. In the first place, the antibody was used in the light antibody method, and the antibody was used in the light antibody method. Please tell me that something is not available, and a small amount of it indicates that it is possible to do so. A large number of yeast cells were detected in the cells of cleavage yeast, and FLAG antibodies were detected by photoantibody method. In the same way, the nuclear bureau is in the process of confirming that there is a problem. The cell cycle is being analyzed in terms of the possibility, the present, the analysis, and so on.

项目成果

Miyake S. et al: "Efficient generation of recombinant adenovirus using adonovirus DNA-terminal protein complex and a cosmid bearing the full-length virus genome." Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93. 1320-1324 (1996)

Miyake S. 等人：“使用腺病毒 DNA 末端蛋白复合物和带有全长病毒基因组的粘粒高效生成重组腺病毒。”

Tsukui T. et al: "Gene transfer and expression in mouse preimplantation embryos by recombinant adenovirus vector." Mol. Reprod. Dev.42. 291-297 (1995)

Tsukui T. 等人：“通过重组腺病毒载体在小鼠植入前胚胎中进行基因转移和表达。”

Kimura K. et al: "Phosphatidylinositol-3 kinase in fission yeast: a possible role in stress responses" Biosci. Biotech. Biochem.59. 678-682 (1995)

Kimura K. 等人：“裂殖酵母中的磷脂酰肌醇 3 激酶：在应激反应中的可能作用”Biosci。

Makimura M. et al: "Induction of antibodies against structural proteins of hepatitis C virus in mice using recombinant adenovirus." Vaccine. 14. 28-34 (1996)

Makimura M. 等人：“使用重组腺病毒在小鼠体内诱导抗丙型肝炎病毒结构蛋白的抗体。”