グルタミン合成酵素多重遺伝子族の機能分化とその生理的意義の研究

谷氨酰胺合成酶多基因家族的功能分化及其生理意义研究

基本信息

批准号：
09760079
负责人：
榊原均
金额：
$ 1.86万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度の研究から、トウモロコシの細胞質基質局在型グルタミン合成酵素(GS1)アイソザイムのうち、不安定型であるGS1dと安定型であるGS1a間の、酵素化学的性質(比活性、熱安定性、Mg^<2+>,Mn^<2+>要求性)の違いには、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖の性質が深く関与していることが示された(論文作成中)。そこで今年度は、このアミノ酸側鎖の立体構造上での位置を含め、植物GS分子の高次構造を明らかにするためトウモロコシGSの結晶化を試みた。大腸菌での発現系を用いて数百mgのGS1を精製し、スパースマトリックス法を用いたクリスタルスクリーンで初期条件を探索した。その後、沈殿剤の濃度・種類、塩濃度、緩衝液のpH・種類等を検討した。その結果、透明度の高い、0.1mm程度の結晶を得たが、予備的なX線照射の結果では散乱X線強度は弱く、空間群、格子定数を求めるには至っていない。昨年度の研究に引き続き、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖のみを安定型(GS1a:Ile_<161>)から不安定型(GS1d:Ala_<161>)へ置換したGS1a161IAタンパク質の物性について解析を行った。その結果、不安定化した置換体GSlはゲルろ過での挙動により、8量体構造が容易に崩れてしまうことが明らかとなり、このアミノ酸側鎖がサブユニット間での相互作用に関与していることが示唆された(論文作成中)。窒素同化系などへ還元力を供給する、フェレドキシン分子種の中から維管束鞘細胞特異的に発現する分子種の遺伝子を単離し、その発現様式を明らかにした。

去年的一项研究表明，第161个疏水性氨基酸残基的侧链与不稳定的GS1D和稳定的GS1A之间的玉米细胞质的GS1A之间的酶呈合成（IS稳定的GS1A）之间的酶（特异性活性，恒温，MG^<2+>>需求）深深地参与了酶的差异（特异性活性，Thermostable，Mg^<2+>>需求）。写作过程）。因此，今年我们试图结晶玉米GS来阐明植物GS分子的较高阶段结构，包括其在氨基酸侧链的三维结构上的位置。使用大肠杆菌中的表达系统纯化了数百毫克的GS1，并使用稀疏基质方法在晶体屏幕上搜索初始条件。之后，检查了沉淀物，盐浓度，pH和缓冲液类型的浓度和类型。结果，获得了高约0.1 mm的晶体，但初步X射线照射的结果显示出弱散射X射线强度，并且未获得空间组和晶格常数。从去年的研究开始，我们分析了GS1A161IA蛋白的物理特性，在该蛋白中，仅从稳定的形式（GS1A：ILE_ <161>）代替疏水性氨基酸残基的侧链，从而将其替换为不稳定的形式（gs1d：ala_____ <1611>）。结果，据显示，由于其在凝胶过滤过程中的行为，不稳定的取代的GSL很容易破坏八聚体的结构，这表明该氨基酸侧链与亚基之间的相互作用有关（在写作过程中）。在血管鞘细胞中特异性表达的分子物种的基因是从铁毒素分子物种中分离出来的，这些物种可为氮同化系统提供降低的能力，并阐明了表达方法。