グルタミン合成酵素多重遺伝子族の機能分化とその生理的意義の研究

昨年度の研究から、トウモロコシの細胞質基質局在型グルタミン合成酵素(GS1)アイソザイムのうち、不安定型であるGS1dと安定型であるGS1a間の、酵素化学的性質(比活性、熱安定性、Mg^<2+>,Mn^<2+>要求性)の違いには、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖の性質が深く関与していることが示された(論文作成中)。そこで今年度は、このアミノ酸側鎖の立体構造上での位置を含め、植物GS分子の高次構造を明らかにするためトウモロコシGSの結晶化を試みた。大腸菌での発現系を用いて数百mgのGS1を精製し、スパースマトリックス法を用いたクリスタルスクリーンで初期条件を探索した。その後、沈殿剤の濃度・種類、塩濃度、緩衝液のpH・種類等を検討した。その結果、透明度の高い、0.1mm程度の結晶を得たが、予備的なX線照射の結果では散乱X線強度は弱く、空間群、格子定数を求めるには至っていない。昨年度の研究に引き続き、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖のみを安定型(GS1a:Ile_<161>)から不安定型(GS1d:Ala_<161>)へ置換したGS1a161IAタンパク質の物性について解析を行った。その結果、不安定化した置換体GSlはゲルろ過での挙動により、8量体構造が容易に崩れてしまうことが明らかとなり、このアミノ酸側鎖がサブユニット間での相互作用に関与していることが示唆された(論文作成中)。窒素同化系などへ還元力を供給する、フェレドキシン分子種の中から維管束鞘細胞特異的に発現する分子種の遺伝子を単離し、その発現様式を明らかにした。

昨年度の研究から、トウモロコシの細胞質基質局在型グルタミン合成酵素(GS1)アイソザイムのうち、不安定型であるGS1dと安定型であるGS1a間の、酵素化学的性質(比活性、熱安定性、Mg^<2+>,Mn^<2+>要求性)の違いには、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖の性質が深く関与していることが示された(論文作成中)。そこで今年度は、このアミノ酸側鎖の立体構造上での位置を含め、植物GS分子の高次構造を明らかにするためトウモロコシGSの結晶化を試みた。大腸菌での発現系を用いて数百mgのGS1を精製し、スパースマトリックス法を用いたクリスタルスクリーンで初期条件を探索した。その後、沈殿剤の濃度・種類、塩濃度、緩衝液のpH・種類等を検討した。その結果、透明度の高い、0.1mm程度の結晶を得たが、予備的なX線照射の結果では散乱X線強度は弱く、空間群、格子定数を求めるには至っていない。昨年度の研究に引き続き、161番目の疎水性アミノ酸残基側鎖のみを安定型(GS1a:Ile_<161>)から不安定型(GS1d:Ala_<161>)へ置換したGS1a161IAタンパク質の物性について解析を行った。その結果、不安定化した置換体GSlはゲルろ過での挙動により、8量体構造が容易に崩れてしまうことが明らかとなり、このアミノ酸側鎖がサブユニット間での相互作用に関与していることが示唆された(論文作成中)。窒素同化系などへ還元力を供給する、フェレドキシン分子種の中から維管束鞘細胞特異的に発現する分子種の遺伝子を単離し、その発現様式を明らかにした。