S-ovalbuminのX線結晶構造解析

S-卵清蛋白的X射线晶体结构分析

• 批准号: 09760131
• 负责人: 高橋 延行
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09760131/
• 关键词: オボアルブミン; 熱安定性; セリンプロテイナーゼインヒビター(serpin); セリンプロテイナーゼ インヒビター(sprpin)

鶏卵の貯蔵中に、卵白の食品機能特性が低下する原因の一つに、主成分であるovalbumin(OVA)が熱安定性の高い分子種、S-OVAに変化することが上げられている。本研究では、その分子機構を明らかにし、タンパク質全般の熱安定化原理の究明に資することを目指し、S-OVA分子の構造特性を見い出すことを目的とした。1) S-OVA単結晶のX線回折実験 従来法(OVAをpH9.9,55℃,16時間加温)により調整したS-○VAについて、微小な板状結晶を得たので、SIEMENS社製X線回折装置により、X線回折実験を行ったところ、5Å程度の分解能の回折像が得られた。OVAについては1.95Å分解能で分子構造モデルが提出されており、今回得られた分解能は、これと比較するには十分でないと考えられた。2) OVA精製方法の検討 高分解能の反射が得られない原因として、S-OVA標品の不均一性を考慮して、鶏卵からOVAを精製する段階と、OVAからS-OVAを調製する段階(次項参照)について改善を試みた。先ず、OVAの精製時に使用している高速液体クロマトグラフィー装置の変更を行った。OVAは分子内にS-S結合を1個と遊離のシステイン残基を4個併せ持つという特徴があり、これらの酸化や、相互変換がOVAの不均一性の原因となると考えられる。従来はOVAの精製時にステンレス製の流路を持ったクロマトグラフィー装置を用いていたため、システイン残基の酸化などを誘導する可能性があった。そこで、PEEK樹脂製流路の検出器を導入し、本タンパク質を金属に接触しない条件で精製することが可能となった。3) S-OVA調製方法の検討 従来のS-OVAの調製法は、pH9.9,55℃,16時間加温という過激な条件であったため、脱アミド化やβ脱離などの化学反応が副次的に起こる可能性があった。そこで、より穏和な条件として反応温度を30℃に下げたところ、1週間の反応時間でS-OVAにおける熱安定化が起こることがわかった。前項の方法で精製したOVAについて、今回定めた反応条件でS-OVAを調製し、X線回折実験に供するための単結晶の調製を試み、板状の結晶を得た。

鶏 eggs の storage 蔵 に, albumen の food functional features low が す る reason の つ に, principal component で あ る ovalbumin (OVA) high thermal stability の が い molecules, S - OVA に variations change す る こ と が on げ ら れ て い る. This study で は, そ の molecular institutions を Ming ら か に し, タ ン パ ク mass all の thermal stabilization principle の investigate Ming に endowment す る こ と を refers し, S - OVA molecular の tectonic features を see い out す こ と を purpose と し た. 1) S-OVA単 crystallization <s:1> X-ray refolding experiment 従 method (OVA を pH9.9, 55 ℃, 16 time heating) に よ り adjustment し た S -.through the VA に つ い て, tiny な plate crystallization を た の で, SIEMENS inflexion in the social system of X line に よ り inflexion by X-ray and be 験 を line っ た と こ ろ, degree of 5 a の can decompose の inflexion like が ら れ た. OVA に つ い て は 1.95 A molecular structure can decompose で モ デ ル が proposed さ れ て お り, today back to ら れ た decomposition can は, こ れ と compare す る に は very で な い と exam え ら れ た. 2) OVA refined methods の 検 for high decomposition reflects の が ら れ な い reason と し て, S - OVA standard product の heterogeneity sex を consider し て, 鶏 eggs か ら OVA を refined す る Duan Jie と, OVA か ら S - OVA を modulation す る Duan Jie (reference) に つ い て try improve を み た. During the first ず and OVA <s:1> refining, に uses the <s:1> て る る る high-speed liquid <s:1> ロ トグラフィ トグラフィ トグラフィ device <e:1> to change the を line った. OVA は intramolecular に S - S combination を と 1 free の シ ス テ イ ン residues を 4 and せ つ と い う, 徴 が あ り, こ れ ら の acidification や, variations in が OVA の inequality a sexual の reason と な る と exam え ら れ る. When 従 to は OVA の refined に ス テ ン レ の ス system flow を hold っ た ク ロ マ ト グ ラ フ ィ を ー device with い て い た た め, シ ス テ イ ン residues の acidification な ど を induced す る possibility が あ っ た. そ こ で, PEEK resin flow の 検 extractor を import し, this タ ン パ ク を metal に contact し な い conditions で refined す る こ と が may と な っ た. 3) S - OVA modulation method is の beg 従 to の 検 S - OVA の は, pH9.9 modulation method, 55 ℃, time of 16 heating と い う ultra な conditions で あ っ た た め, ア ミ ド change や beta from な ど の chemical anti 応 が vice times of に こ る possibility が あ っ た. そ こ で, よ り is one and the conditions of な と し て anti を 応 temperature 30 ℃ under に げ た と こ ろ, 1 week between の 応 time で S - OVA に お け る thermal stabilization が up こ る こ と が わ か っ た. Referred to in the preceding paragraph の way で refined し た OVA に つ い て, today back to め た anti 応 conditions で S - OVA を し modulation, X-ray inflexion be 験 に for す る た め の 単 crystallization の modulation を み, tabular の crystallization を た.

项目成果

M.Onda: "Refolding process of Ovalbumin from Urea-denatured State:Evidence for the Involvement of Nonproductive Side Chain Interactions in an Early Intermediate" Journal of Biological Chemistry. 272・7. 3973-3979 (1997)

M. Onda：“来自尿素变性状态的卵清蛋白的重折叠过程：早期中间体中非生产性侧链相互作用的证据”《生物化学杂志》272・7（1997）。

M.Onda: "Refolding of Urea-denatured Ovalbumin That Comprises Non-Native Disulfide lsomers" Journal of Biochemistry. 122・1. 83-89 (1997)

M. Onda：“包含非天然二硫键异构体的尿素变性卵清蛋白的重折叠”《生物化学杂志》122・1（1997）。