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酵母-インフルエンザレプリコン系の確立とその応用

酵母-流感病毒复制子系统的建立及其应用

基本信息

批准号：
09770207
负责人：
飯塚成志
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Nagoya City University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1997
资助国家：
日本
起止时间：
1997 至 1998
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究はインフルエンザウイルスの複製関連タンパク質を酵母細胞内で発現させ、インフルエンザウイルスのRNAレプリコンを機能させることを目的とした研究であった。4つの複製タンパク質とcap-1型mRNAを発現させることにより,弱いながらも転写反応の再現は見られたものの,ゲノム複製反応の再現は見られなかった。この研究過程において、GSTタンパク質との融合タンパク質として酵母細胞内で外来タンパク質を発現させ,穏和な条件で外来タンパク質を精製して他のサブユニットタンパク質を単離同定する系を開発した。この系を利用して、酵母転写因子のある種の核内移行が酸化ストレスに感受性であることが証明された(発表ずみ).一方、細胞抽出液を用いてウイルス複製関連タンパク質を解析している過程で、インビトロで複製関連タンパク質を翻訳・発現させてRNAゲノムの複製を試みた。この系においてインフルエンザウイルスゲノムの複製は観察できなかったものの、増幅するRNAレプリコンが存在することがわかった。これは細胞全タンパク抽出液のS-30分画内で増幅するものであり、酵母細胞質由来のレプリコンである.少なくともそのうちの一つは酵母のdsRNAウィルスであるL-Aであることが予想された。L-Aを含まない株を使用して抽出液作製を行った場合には、先に見られた強いレプリコン活性は観察されなかった。またL-Aを酵母から精製しておき、L-Aフリーの抽出液に添加した場合には,レプリコン活性が観察された。この実験は、すべて無細胞抽出液で行っており、RNA複製、翻訳、転写のすべての反応が無細胞で行われたことを示唆する。実際,微量の反応液を出発材料としてスケールアップ可能であり、成熟ウイルスが回収された。この系は、歴史上ウイルスを無細胞で増殖させることのできる初めての系となる可能性がある.

In this study, we found that the replication-related properties of yeast cells are related to the quality of yeast cells.フルエンザウイルスのRNAレプリコンを Function させることを Purpose とした Research であった. 4つの copy タンパク性とcap-1 type mRNA を発appears させることにより, weak いながらも転WRITE 远のappearanceは见られたものの, ゲノム copy 远のappearance は见られなかった.このResearch processにおいて、GSTタンパク性とのfusion タンパク性としてExternal タンパク性を発appearance in yeast cellsさせ,珏和なconditionsで外タンパクqualityをrefinedしてのサブユニットタンパクqualityを単出同定するSystemを开発した. The system uses して and the yeast 転WRITE factor のあるkind のnuclear migration が acidification ストレスに sensitivities であることがproven された (発表ずみ). One side, cell extract solution is usedいてウイルスCopy related タンパクqualityをanalyticsしているprocessで、インビトロでCopy related タンパク性を訳・発现させてRNAゲノムの copyをtrialみた.この线においてインフルエンザウイルスゲノムの copy は観看できなかったものの、increased width するRNAレプリコンがexistent することがわかった.これは whole cell extract タンパクのS-30 points within the picture でincreased width するものであり, yeast cytoplasm origin のレプリコンである.小なくともそのうちの一つはYeastのdsRNAウィルスであるL-Aであることがyu思された. L-A をcontaining まないを uses して extracted liquid to make を行ったoccasion には, first に见られた强いレプリコン active は観看されなかった.またL-A を yeast から purification しておき, L-A フリーの extract solution に addition した occasion には, レプリコン active が観看された.この実験は, すべてcell-free extract liquid で行っており, RNA replication, translation, 転WRITE のすべてのanti-応がcell-free で行われたことをshows 唆する. In the meantime, it is possible to recover trace amounts of anti-reaction fluid from raw materials and mature materials.この线は、歴史ウイルスをAcellular でproliferationさせることのできるInitial めての线となる possibility がある.