酵母-インフルエンザレプリコン系の確立とその応用

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本研究はインフルエンザウイルスの複製関連タンパク質を酵母細胞内で発現させ、インフルエンザウイルスのRNAレプリコンを機能させることを目的とした研究であった。4つの複製タンパク質とcap-1型mRNAを発現させることにより,弱いながらも転写反応の再現は見られたものの,ゲノム複製反応の再現は見られなかった。この研究過程において、GSTタンパク質との融合タンパク質として酵母細胞内で外来タンパク質を発現させ,穏和な条件で外来タンパク質を精製して他のサブユニットタンパク質を単離同定する系を開発した。この系を利用して、酵母転写因子のある種の核内移行が酸化ストレスに感受性であることが証明された(発表ずみ).一方、細胞抽出液を用いてウイルス複製関連タンパク質を解析している過程で、インビトロで複製関連タンパク質を翻訳・発現させてRNAゲノムの複製を試みた。この系においてインフルエンザウイルスゲノムの複製は観察できなかったものの、増幅するRNAレプリコンが存在することがわかった。これは細胞全タンパク抽出液のS-30分画内で増幅するものであり、酵母細胞質由来のレプリコンである.少なくともそのうちの一つは酵母のdsRNAウィルスであるL-Aであることが予想された。L-Aを含まない株を使用して抽出液作製を行った場合には、先に見られた強いレプリコン活性は観察されなかった。またL-Aを酵母から精製しておき、L-Aフリーの抽出液に添加した場合には,レプリコン活性が観察された。この実験は、すべて無細胞抽出液で行っており、RNA複製、翻訳、転写のすべての反応が無細胞で行われたことを示唆する。実際,微量の反応液を出発材料としてスケールアップ可能であり、成熟ウイルスが回収された。この系は、歴史上ウイルスを無細胞で増殖させることのできる初めての系となる可能性がある.