アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた中枢解毒機構のスクリーニング-血液脳関門における能動的物質排出-

使用反义寡核苷酸筛选中枢解毒机制 - 活性物质在血脑屏障的排泄 -

• 批准号: 09772055
• 负责人: 松尾 浩民
• 金额: $ 1.15万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 1997
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1997 至 1998
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-09772055/
• 关键词: 血液脳関門; P糖タンパク質; 膜融合リポソーム; アンチセンスオリゴヌクレオチド; MBEC4細胞

【目的】血液脳関門における排出輸送機構および制御因子を明らかにするために、アンチセンスを用いた中枢解毒機能の定量的スクリーニング法の開発を目的とする。本研究ではマウス脳毛細血管内皮細胞(MBEC4)へ膜融合リポソームによるアンチセンスの導入についてFITCでラベしたアンチセンスオリゴヌクレオチド(FITC-ODN)を用い検討を行った。【方法】膜融合リポソームの調製:ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、コレステロールを基材とし、脂質薄膜を作成した。これにFITC-ODN溶液を添加し、振とうすることによりリポソームを調製した。さらに紫外線照射により不活性化したセンダイウイルス(HVJ)を加え、インキュベーションした後に融合していないHVJをショ糖密度勾配遠心法により除去し、FITC-ODN封入膜融合リポソーム(FITC-HVJ-Lip)を調製した。膜融合リポソームによるMBEC4細胞へのFITC-ODNの導入:MBEC4細胞にFITC-HVJ-Lipを投与し、4℃で10分間、37℃で30分間インキュベーションした。その後、培地に置き換え、5分、1時間、1日、3日間培養した。各時間における細胞内蛍光強度の測定および蛍光顕微鏡による観察を行った。【結果・考察】FITC-HVJ-Lipで処理したMBEC4細胞においてのみ、FITC-ODN単独投与と比較し、強い蛍光シグナルが蛍光顕微鏡により観察され、この細胞内における蛍光シグナルは投与3日後でも認められた。また、蛍光強度測定の結果、FITC-HVJ-Lipを用いた方法ではFITC-ODN単独投与と比較し、約2.5倍高い蛍光強度が認められた。さらに、細胞内に導入されたFITC-ODNのほとんどがintactであることが示唆された。以上の結果より、膜融合リポソームはMBEC4細胞内にアンチセンスを効率良く導入可能であることが示された。

【 objective 】 the blood 脳 masato door に お け る discharge transportation agency お よ び suppression factor を Ming ら か に す る た め に, ア ン チ セ ン ス を with い た central detoxification function の quantitative ス ク リ ー ニ ン グ method の open 発 を purpose と す る. This study で は マ ウ ス 脳 capillary endothelial cells (MBEC4) へ membrane fusion リ ポ ソ ー ム に よ る ア ン チ セ ン ス の import に つ い て FITC で ラ ベ し た ア ン チ セ ン ス オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ド (FITC - ODN) を い 検 line for を っ た. 【 method 】 membrane fusion リ ポ ソ ー ム の modulation: ホ ス フ ァ チ ジ ル セ リ ン, ホ ス フ ァ チ ジ ル コ リ ン, コ レ ス テ ロ ー ル を substrate と し, lipid membrane を し た. <s:1> れにFITC-ODN solution を add を, vibrate とうする とうする とによ リポソ リポソ ムを ムを ムを modulate た た. さ ら に ultraviolet irradiation に よ り not activeness し た セ ン ダ イ ウ イ ル ス (HVJ) を え, イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た に after fusion し て い な い HVJ を シ ョ hook with much sugar density method to に よ り remove し membrane fusion sealed, FITC ODN リ ポ ソ ー ム (FITC - HVJ - Lip) を modulation し た. Membrane fusion リ ポ ソ ー ム に よ る MBEC4 cells へ の FITC - ODN の import: MBEC4 cells に FITC HVJ - Lip を cast with し, 4 ℃ between で 10 points, 37 ℃ で 30 points between イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た. After そ そ, the culture ground に was set to え and then incubated for 5 minutes, 1 time, 1 day, and 3 days for た た. The intracellular 蛍 light intensity <s:1> was determined at each time, and the および蛍 light 顕 microscope による観 was used to examine the を line った. FITC - HVJ - the result, examine 】 【 Lip で 処 Richard し た MBEC4 cells に お い て の み, FITC ODN 単 vote compared with と し alone, strong い 蛍 light シ グ ナ ル が 蛍 light 顕 micromirror に よ り 観 examine さ れ, こ の intracellular に お け る 蛍 light シ グ ナ ル は later cast and 3 で も recognize め ら れ た. ま た, 蛍 light intensity measurement の results, FITC HVJ - Lip を with い た method で は FITC - ODN 単 vote compared with と し alone, about 2.5 times as high い 蛍 light intensity が recognize め ら れ た. Youdaoplaceholder0 intracellular に introduction of されたFITC-ODN ほとん ほとん がintactである である とが とが to indicate された. の above results よ り, membrane fusion リ ポ ソ ー ム は MBEC4 intracellular に ア ン チ セ ン ス を sharper rate good く import may で あ る こ と が shown さ れ た.