抗腫瘍性ヒト型モノクローナル抗体NCC−ST421の作成と臨床応用

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本研究ではDNAの組換え技術ならびにマイクロタイタープレート法によるスクリーニングを用い、ヒト型NCC-ST421抗体をコードするcDNAのクローニングを効率的に行い、動物細胞にトランスフェクションしてヒト型NCC-ST421抗体を産生ずる細胞を作成する。さらにマウスのNCC-ST421抗体と同程度以上の抗腫瘍効果を持つ抗体を産生する細胞をin vitro、in vivoでスクリーニングし、臨床応用への可能性を検討する。1) NCC-ST421を産生するハイブリドーマからAGPC法によりtotal RNAを抽出する。L鎖及びH鎖の可変(V)領域をコードするmRNAのそれぞれの領域から、特異的なプライマーを用い逆転写酵素によりcDNA作成し、電気泳動により分離する。2) PCR法を用いcDNAを増幅させL鎖V領域及びH鎖V領域をそれそれ動物細胞発現型cDNAクローニングベクターに組み込み大腸菌で増幅させる。そしてそれらを用いL鎖V領域、H鎖V領域、ヒトの定常(C)領域をコードする塩基配列を有した一本の発現ベクターにさらに再構築する。3) マイクロタイタープレート法2)で作成した発現cDNAベクターをトランスフォームして得られた数百クローンの大腸菌をマイクロプレートで増殖させマスタープレートを作成する。マスタープレートからコピーマイクロプレートを複製し、その上でベクターの抽出、DEAE-デキストラン法によるCOS7細胞へのトランスフェクションを行い、一過性にキメラ抗体を産生させる。その中で親株由来であるマウスモノクローナル抗体NCC-ST421と同程度もしくはそれ以上の抗原結合性、抗腫瘍性を有する抗体を産生する細胞をin vitroでスクリーニングし、トランスフォームされた目的とする大腸菌をマスタープレートから選択し、キメラ抗体のcDNAをクローン化する。