ケミカルリゲーション法を用いたHIVプロテアーゼ誘導体の合成研究

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HIVプロテアーゼは99アミノ酸よりなるアスパルチックポロテアーゼの一種で,エイズ治療のターゲットとして薬剤が開発され効果をあげている.しかし本酵素は数残基のアミノ酸変異により薬剤耐性を獲得する.そのため耐性の研究に変異プロテアーゼが必要となった.本酵素は主に遺伝子組み替え法により合成されるが,多種類の変異プロテアーゼを得ることは困難である.本研究は近年開発されたケミカルリゲーション法を用いた化学合成により,HIVプロテアーゼ誘導体およびその変異体を合成し,変異プロテアーゼに有効な阻害剤の開発に役立てることを目的とする.本年度は平成10年度の計画1-3によりチオールとアルキルハライドからスルフィド結合を得るケミカルリゲーション法を用いて合成したHIVプロテアーゼ誘導体の活性評価を行った.4 HIVプロテアーゼ誘導体の活性測定 昨年度計画3により得られた高純度のHIVプロテアーゼ誘導体をフォールディングして活性型のダイマーとし,合成基質を用いてその活性を評価した.活性評価はHPLCを用いて,酵素により切断された基質断片の量を定量した.基質として,7残基アミノ酸よりなるペプチド基質(Phe-Proタイプ)と,分子内消光を利用した9残基アミノ酸からなる蛍光基質(Phe-Pheタイプ)の二種類の基質を,Fmoc型固相ペプチド合成法により合成して用いた.合成した酵素は特異的な基質切断能を有していた.5 HIVプロテアーゼ誘導体に対する阻害剤の活性評価 得られたHIVプロテアーゼ誘導体を用い,既存のプロテアーゼ阻害剤(サキナビル,リトナビル,インディナビル,KNI-272等)による阻害活性を測定した.これらの阻害剤に対する感受性は,天然型酵素より低下していた.