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小胞体局在PDIファミリー蛋白質のBPTI refolding活性に与える影響

内质网定位的 PDI 家族蛋白对 BPTI 重折叠活性的影响

基本信息

批准号：
10780452
负责人：
佐藤衛
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

平成10〜11年におこなった研究より、ERp61とERp72は、PDIと同様にBPTIのrefolding反応を促進させること、ERp61とERp72はPDIよりも早く一部の還元型BPTIを成熟型へとrefo1dingさせるにも関わらず・反応720分後でもrefolding中間体が残存していることが判った。この原因を探るべく、二つのrefolding中間体N'(Cys30-Cys51、Cys14-Cys38に二つのジスルフィド結合を持つ)とN^*(Cys5-Cys55、Cys14-Cys38に二つのジスルフィド結合を持つ)を用いて解析したところ、ERp61とERp72は、N'から成熟型への反応は促進できるが、N^*から成熟型への反応は、ほとんど促進できないことがわかった。BPTI refoldingにおける各PDIファミリー蛋白質のチオレドキシン領域の作用の違いを解析するため、PDI、ERp72、ERp61の各チオレドキシン領域のシステイン残基のセリン残基への置換を試みた。ERp72はPDIやERp61と異なり3箇所のチオレドキシン領域を持つが、各領域が蛋白質のS-S結合形成/異性化にどのように関与しているかについては不明である。正常型と3箇所のアミノ酸置換と組み合わせによる変異型の計8種類のERp72にヒスチジンタッグを付加し大腸菌で発現させた。Ni-NTAカラムでのアフィニティー精製、resource Qカラムでのリクロマトグラフィーをおこない、SDS-PAGE・CBB染色で確認したところ、ほぼ単一バンドとして精製することができた。3箇所すべてのチオレドキシン領域のシステイン残基を置換した変異体では、インスリン還元活性はバックグラウンドレベルにまで活性が低下した。次に、N末端に最も近いチオレドキシン領域(ドメイン1)の変異型では、Vmaxが約1/2の活性にまで低下した。さらに中央のチオレドキシン領域(ドメイン2)の変異型では、Vmaxが約1/2の活性に低下した。しかしC末端に最も近いチオレドキシン領域(ドメイン3)を置換した変異体ではほとんどVmaxには影響がなかった。以上の結果より、インスリン還元反応にはERp72に存在する3カ所のチオレドキシン領域のうち、ドメイン1とドメイン2S-S結合形成/異性化に寄与しているが、ドメイン3はほとんど作用していないことが判った。

Heisei 10~11 におこなった Research より、ERp61とERp72は、PDIと同様にBPTIのrefolding anti-reaction promotion させること、ERp61とERp72はP DIよりもEarly one part no return type BPTIをmature type へとrefo1ding させるにも关わらず・Reaction 720 minutes later, でもrefolding intermediate が remains していることがadjusted った.このCauseをExploringるべく、二つのrefolding intermediate N' (Cys30-Cys51, Cys14- Cys38に二つのジスルフィドcombinationをholdつ)とN^*(Cys5-Cys55, Cys14-Cys3 8に二つのジスルフィドcombineをholdつ)を用いてanalyticsしたところ、ERp61とERp72は、N'からMature type へのreaction は promotes できるが, N^*から mature type へのreaction は, ほとんど promotes できないことがわかった. BPTI refolding each PDI ファミリーprotein のチオレドキシンfield のeffect のviolation いをanalytic するため, PDI, ERp72, ERp61 each チオレドキシン domain のシステイン residue のセリン residue への substitution を test みた. ERp72, PDI, ERp61, different fields The S-S combination of がprotein forms/heterosexualized にどのように关 and しているかについてはUnknown である. There are a total of 8 types of normal type, 3 type, acid replacement, combination, and abnormal type. The type of ERp72 is the same as the coliform bacteria. Ni-NTA カラムでのアフィニティーrefined, resource Qカラムでのリクロマトグラフィーをおこない、SDS-PAGE・CB B dyeing is confirmed by the dyeing method, and the dyeing is confirmed by the dyeing method and the dyeing method is refined. 3箇sho すべてのチオレドキシン区のシステイン簪をsubstitutionした変variantでは, インスリン restored active はバックグラウンドレベルにまでactive low した. The N-terminal is the closest to the N-terminal area (ドメイン1), the abnormal shape, and the Vmax is about 1/2 of the activity, and the activity is low. The center of the center of the field (ドメイン2) has a special shape, Vmax is about 1/2, and the activity is low.しかしC-terminal にmostもNearly いチオレドキシン区(ドメイン3)を Replacement した変variant ではほとんどVmaxには affects がなかった. The result of the above is より, インスリン return to the original anti-には ERp72 に 3 カ place のチオレドキシン区のうち, ドメイン1とドメイン2S-S combines to form/heterosexualized に日 with しているが, ドメイン3はほとんどeffect していないことが看った.