Far-Western法を利用したウイルスのレプリカーゼを構成する宿主因子の同定

利用Far-Western方法鉴定构成病毒复制酶的宿主因子

• 批准号: 12760031
• 负责人: 海道 真典
• 金额: $ 1.34万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12760031/
• 关键词: 宿主因子; Brome Mosaic Virus; 細胞間移行; Gene Silencing; TOM1遺伝子

本研究の目的はBrome Mosaic Virus(BMV)が宿主植物に全身感染するために必須の宿主因子遺伝子を単離することである。筆者はBMVの移行に関与する3aタンパク質と直接結合するタンパク質をコードするNicotiana. benthamiana植物遺伝子18個をそのcDNAライブラリーからFar-Western Blotting法によって単離したことを昨年報告した。そこでこれらの候補遺伝子が本当にBMVの移行に関与するかどうかを調べるために、その遺伝子発現を抑制した形質転換植物の、作出し、そのような植物においてBMV感染が抑制されるか否かを調べた。近年、導入遺伝子が二本鎖RNAの形で発現する形質転換植物ではPost Transcriptional Gene Silencing(PTGS)の誘導によって高い確率で導入遺伝子およびそれと高い相同性をもつ内在性遺伝子の発現が共に抑制されることが明らかとなった。そこでシロイヌナズナの変異体から単離されたTobacco mosaic virus(TMV)の増殖に関与するTOM1遺伝子のN. benthamianaにおけるホモログであるNbTOM1遺伝子を単離し、この一部分を三本鎖RNAとして発現する形質転換N. benthamianaを作出した。これらの植物では内在性のTOM1 RNAの蓄積量が減少し、さらにTMV接種に対して病徴の進展が遅延することがわかった。この結果からPTGSによる内在性遺伝子発現の抑制が宿主遺伝子探索に応用できることが判明したので、18個の候補遺伝子についても同様に形質転換植物を作出した。18個の遺伝子のうちこれまで1つの遺伝子(nascent polypeptide associated complex α=NAC遺伝子)についてのみ解析が終了している。二本鎖NACを発現する形質転換植物10ラインについてBMV接種実験を行ったが、BMV感染が阻害されるものは無く、逆にBMV蓄積量が若干増加するラインがいくつかあったことから、NAC遺伝子にはBMV感染を制御する機能があると推測している。現在、残りの遺伝子についても形質転換植物のBMV感染実験を継続している。

这项研究的目的是将Brome Mosaic病毒（BMV）必不可少的宿主因子基因分离为系统性传染性宿主植物。作者于去年报道说，18个尼古蒂亚纳·本塔米亚植物基因，该基因编码直接结合BMV转移的3A蛋白的蛋白质，通过远西方的吸毒方法从其cDNA文库中分离出来。因此，为了研究这些候选基因是否确实参与了BMV的转移，我们研究了抑制其基因表达的转化植物的产生，以及在此类植物中是否抑制了BMV感染。近年来，已经揭示了转录后基因沉默（PTG）的诱导既抑制了转基因的表达和具有高同源性的内源基因的表达，而转化的植物中的转基因在转化的植物中以双重RNA的形式表达了转基因。因此，nBTOM1基因是托巴科摩西病毒（TMV）的Tom1基因的N. benthamiana中的同源物，从拟南芥突变体中分离出来，分离出来，并产生了本塔米亚氏菌的n. n. bnenthamiana。这些植物显示内源性TOM1 RNA积累的减少，并延迟了通过TMV接种的疾病症状的进展。该结果表明，PTG对内源基因表达的抑制可以应用于宿主基因搜索，并类似地针对18种候选基因产生了转化的植物。在这18个基因中，到目前为止，分析仅针对一个基因（新生多肽相关的复合物α= NAC基因）完成。我们对表达双链NAC的10条转化的植物进行了BMV接种实验，但它们都没有抑制BMV感染，相反，有几条线略微增加了BMV积累的量，因此我们推测NAC基因具有控制BMV感染的功能。当前，实验继续在带有其余基因的转化植物中感染BMV。

项目成果

Diez et at.: "Identification and characterization of a host protein required for efficient template selection in viral RNA replication"Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97. 3913-3918 (2000)

Diez 等人：“病毒 RNA 复制中有效模板选择所需的宿主蛋白的鉴定和表征”Proc。

Diez et al.: "Identification and characterization of a host protein required for efficient template selection in viral RNA replication"Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 97. 3913-3918 (2000)

Diez 等人：“病毒 RNA 复制中有效模板选择所需的宿主蛋白的鉴定和表征”Proc.Natl.Acad.Sci.USA。

Kaido: "Host factors involved in the multiplication of Brome Mosaic Virus"PSJ Plant-Microbe Interactions Symposium Reports. 36. 113-122 (2000)

Kaido：“参与雀麦花叶病毒增殖的宿主因素”PSJ植物-微生物相互作用研讨会报告。