新規なRNAi抑制活性をもつダイアンソウイルスの移行機構の解明

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申請者は17年度中に、Nicotiana benthamiana植物のNbNACa1遺伝子の発現をサイレンシングによって抑制したGSNAC植物ではRed clover necrotic mosaic virus(RCNMV)の細胞間移行が顕著に抑制され、またRCNMVの移行タンパク質(MP)とGFPとの融合タンパク質(RMP-GFP)の原形質連絡糸(Pd)への局在が遅延することから、NbNACa1遺伝子がRCNMVの細胞間移行に関与する宿主因子遺伝子であるという可能性を見いだした。18年度はこれらの結果を受けて、RCNMVとNbNACa1タンパク質がN.benthamiana細胞中で結合するか否か免疫沈降法によって調べたところ、抗NbNACa1抗体免疫沈降画分からRCNMV MPが特異的に検出できたことから、両タンパク質が結合することがわかった。この結果はNbNACa1タンパク質のRCNMV細胞間移行に及ぼす影響がタンパク質同士の結合を介した直接的なものであることを示唆している。さらにRMP-GFPを発現する組み換えRCNMVをN.benthamianaのプロトプラストに接種して細胞レベルでのRMP-GFPの局在性について調べたところ、感染16時間後には細胞周縁部に小さな不定形の蛍光の固まりが百個以上確認され、接種24時間後くらいまで時間の経過とともに蛍光の固まりが徐々に大きくなり、細胞表面をほとんど埋め尽くすように分布する様子が確認された。またN.benthamiana葉の細胞では感染後期におそらく微少管への分布を表すと思われる繊維状の蛍光が観察された。この結果はTobacco mosaic virusのMPとGFPの融合タンパク質のタバコ細胞における局在パターンとよく似ており、RCNMV MPが小胞体膜上で合成された後、徐々に細胞周縁の小胞体膜上で複製酵素複合体や外被タンパク質とともに巨大な複合体を形成した後にPdに移行するものと考えられる。またPdを含む細胞壁画分を抽出してウェスタン分析したところNbNACa1タンパク質が含まれることがわった。現在、NbNACa1がRCNMV MPのPd局在性にどのように関与するのかを明らかにするべく、NbNACa1と蛍光タンパク質との融合タンパク質の細胞内局在性について調べるとともに、GSNACプロトプラスト内でのRMP-GFP局在について調べている。