新規シグナル分子BLNKの機能発現メカニズムの解析

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昨年度の解析により、BLNKの機能発現に重要なドメイン(SH2、プロリンリッチ領域)を同定した。これらのドメインに結合するタンパク質とBLNKがB細胞レセプター(BCR)刺激依存的に複合体を形成することが下流エフェクター分子の活性化の重要なメカニズムと考えられる。従って、本年度はBLNKへの結合分子をyeast two-hybrid法により単離することを計画した。BLNKをbaitとしてシステムを構築した。予備実験としてprey側を既にBLNKとの結合が知られているGrb2およびGadsに設定して検討したところ、BLNK-Grb2,BLNK-Gadsのどちらの結合も検出でき、このシステムが機能することを確認した。DT40B細胞由来のcDNAライブラリーを2種のスクリーニングマーカー遺伝子の発現を指標にスクリーニングしたところ、二重陽性クローンとして10個の候補を得た。塩基配列解析によりRuk/CIN85(2クローン)、C3IP1(3クローン)、EAP30、ribosomal protein S26などと判明した。同定した分子のうち、RukとC3IP1についてさらに解析を進めた。BLNK-C3IP1複合体の形成は293T細胞への共発現、免疫沈降法によっても確認された。BLNK-Rukの結合は他のグループからも報告されている。RukおよびC31P1とBLNKの相互作用の生理的意義を明らかにするため、それぞれの遺伝子のゲノムDNAをクローニングし、ターゲティングコンストラクトを作製し、DT40細胞を用いてそれぞれの欠損細胞を樹立した。現在、解析中である。