新規シグナル分子BLNKの機能発現メカニズムの解析

新型信号分子BLNK的功能表达机制分析

• 批准号: 12770077
• 负责人: 石合 正道
• 金额: $ 1.54万
• 依托单位: Kawasaki Medical School (2001)Kansai Medical University (2000)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 2001
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-12770077/
• 关键词: B細胞レセプター; シグナル伝達; アダプター分子; BLNK; yeast two-hybrid; BCR; Igα; SH2ドメイン; GEM分画

昨年度の解析により、BLNKの機能発現に重要なドメイン(SH2、プロリンリッチ領域)を同定した。これらのドメインに結合するタンパク質とBLNKがB細胞レセプター(BCR)刺激依存的に複合体を形成することが下流エフェクター分子の活性化の重要なメカニズムと考えられる。従って、本年度はBLNKへの結合分子をyeast two-hybrid法により単離することを計画した。BLNKをbaitとしてシステムを構築した。予備実験としてprey側を既にBLNKとの結合が知られているGrb2およびGadsに設定して検討したところ、BLNK-Grb2,BLNK-Gadsのどちらの結合も検出でき、このシステムが機能することを確認した。DT40B細胞由来のcDNAライブラリーを2種のスクリーニングマーカー遺伝子の発現を指標にスクリーニングしたところ、二重陽性クローンとして10個の候補を得た。塩基配列解析によりRuk/CIN85(2クローン)、C3IP1(3クローン)、EAP30、ribosomal protein S26などと判明した。同定した分子のうち、RukとC3IP1についてさらに解析を進めた。BLNK-C3IP1複合体の形成は293T細胞への共発現、免疫沈降法によっても確認された。BLNK-Rukの結合は他のグループからも報告されている。RukおよびC31P1とBLNKの相互作用の生理的意義を明らかにするため、それぞれの遺伝子のゲノムDNAをクローニングし、ターゲティングコンストラクトを作製し、DT40細胞を用いてそれぞれの欠損細胞を樹立した。現在、解析中である。

Last year 's <s:1> analysis of によ によ, the occurrence of BLNK function に important なドメ <s:1> <s:1> <e:1> (SH2, プロリ <e:1> リッチ fields)を fixed た た. こ れ ら の ド メ イ ン に combining す る タ ン パ ク qualitative と BLNK が B cells レ セ プ タ ー (BCR) stimulus dependent に complex を form す る こ と が obscene エ フ ェ ク タ ー molecular の activeness の important な メ カ ニ ズ ム と exam え ら れ る. 従 っ て, this year's は BLNK へ の combining molecular を yeast two hybrid method に よ り 単 from す る こ と を project し た. BLNKをbaitと てシステムを てシステムを construct た た. Reserve be 験 と し て prey side を both に BLNK と の combining が know ら れ て い る Grb2 お よ び Gads に set し て beg し 検 た と こ ろ, BLNK - Grb2 BLNK - Gads の ど ち ら の combining も 検 out で き, こ の シ ス テ ム が function す る こ と を confirm し た. DT40B cell origin の cDNA ラ イ ブ ラ リ ー を two の ス ク リ ー ニ ン グ マ ー カ ー posthumous son 伝 の 発 now を index に ス ク リ ー ニ ン グ し た と こ ろ, double positive ク ロ ー ン と し て 10 の alternate を た. Analysis of base coordination によ Ruk/CIN85(2 <s:1> ロ ロ <e:1> <e:1>), C3IP1(3 <s:1> ロ <e:1> <e:1>), EAP30, ribosomal protein S26な <s:1> と determine た. Fix the <s:1> た molecule うち うち, RukとC3IP1に に てさらに てさらに てさらに analyze を into めた. The BLNK-C3IP1 complex <s:1> forms へ 293T cells へ co-occurrence, immunoprecipitation によって confirmation された. BLNK-Ruk <s:1> combined with his <s:1> グ プ プ プ ら ら report されて る る. Ruk お よ び C31P1 と BLNK の interaction の physiological significance を Ming ら か に す る た め, そ れ ぞ れ の posthumous son 伝 の ゲ ノ ム DNA を ク ロ ー ニ ン グ し, タ ー ゲ テ ィ ン グ コ ン ス ト ラ ク ト を for し, DT40 cells を い て そ れ ぞ れ の owe damaged cells を set し た. Now, in the analysis である.

项目成果

Wong,J. et al.: "Functional complementation of BLNK by SLP-76 and LAT linker proteins."J.Biol.Chem.. 275. 33116-33122 (2000)

黄，J.

Ishiai,M. et al.: "Involvement of LAT, Gads, and Grb2 in compartmentation of SLP-76 to the plasma membrane."J.Exp.Med.. 192. 847-856 (2000)

石合，M.

Goitsuka, R: "MIST functions through distinct domains in immunoreceptor signaling in the presence and absence of LAT"J. Biol. Chem.. 276. 36043-36050 (2001)

Goitsuka, R：“在存在和不存在 LAT 的情况下，MIST 通过免疫受体信号传导中的不同域发挥作用”。

Kurosaki, T.et al.: "Regulation of phospholipase C-γ2 pathway in B cells"Immunol. Rev.. 176. 19-29 (2000)

Kurosaki，T.等：“B细胞中磷脂酶C-γ2途径的调节”Immunol.176.19-29(2000)。

Inabe, K.: "Vav3 modulates B cell receptor responses by regulating phosphoinositide 3-kinase activation"J. Exp. Med.. 195. 189-200 (2002)

Inabe, K.：“Vav3 通过调节磷酸肌醇 3-激酶激活来调节 B 细胞受体反应”J.