モデル動物を用いた不全心筋の収縮及び細胞内カルシウム動態に関する研究

本年度の実験内容は、ラットより単離した心筋細胞内カルシウムイオン濃度変化(Ca^<2+> transients)と細胞長変化の同時測定並びに、細胞内水素イオン濃度変化(pH_i)を測定可能な実験装置を用いて、収縮蛋白系Ca反応性に対するホスホキナーゼC(PKC)阻害薬の反応を見た。昨年と同様に、0.2μMのthapsigarginによる前処置後、10Hz・10秒間の電気刺激中に得られたCa^<2+> transientsと細胞長変化(L)を同一グラフ上にプロットすると、細胞内に存在する収縮蛋白のCa^<2+>に対する感受性を知ることが出来る(Ca-L trajectory)。このCa-L trajectoryは、α受容体刺激薬(phenylephrine)によって容量依存性にグラフ上で左にシフトし、これは収縮蛋白系のCa^<2+>感受性増強を意味する。PKC阻害によりα受容体刺激による細胞内Ca-短縮関係のシフトは完全に抑制された。細胞内pHの変化もPKC阻害により抑制された。またこの系を用いて、c-AMP依存性反応についても検討した。Β受容体刺激及びPDE阻害薬により、Ca-L trajectoryは右にシフトした。またその時の細胞内c-AMP濃度はシフトの程度が同じにもかかわらず、PDE阻害薬のほうがβ受容体刺激に比し上昇していた。これらより本実験系を用いた、定常状態での細胞内Ca測定と細胞長変化の同時測定が確立され、生理活性物質である、カテコラミンの反応も確認できた。Α受容体刺激によるCa-L trajectoryのシフトはPKCを介した、細胞内アルカリ化によって起こることが確認された。一方、β受容体刺激はCa感受性を低下させることが確認され、c-AMPの上昇からPKAを介した反応であることが確認された。しかし、同様にc-AMPの上昇を起こすPDE阻害薬との比較検討を行ったところ、Ca-L trajectoryのシフトの程度は同じであったが、細胞内c-AMP濃度はPDE阻害においてより増大していた。つまり、細胞内収縮蛋白系におけるCa感受性の低下はβ受容体刺激のほうが、PDE阻害よりも効率よく効果を発現することがわかった。これらの結果を踏まえた上で、肥大心筋での機能評価を行うべく、肥大心筋モデルの作成に取り掛かった。麻酔下、人工呼吸管理下で大動脈を狭窄し圧負荷モデルを作成しつつある。今後この心臓より取り出した細胞から生理活性物質である、カテコラミンα及びβ受容体刺激の収縮蛋白系Ca反応性に対する反応を調べ、正常心筋と比較検討していく予定である。

本年度の実験内容は、ラットより単離した心筋細胞内カルシウムイオン濃度変化(Ca^<2+> transients)と細胞長変化の同時測定並びに、細胞内水素イオン濃度変化(pH_i)を測定可能な実験装置を用いて、収縮蛋白系Ca反応性に対するホスホキナーゼC(PKC)阻害薬の反応を見た。昨年と同様に、0.2μMのthapsigarginによる前処置後、10Hz・10秒間の電気刺激中に得られたCa^<2+> transientsと細胞長変化(L)を同一グラフ上にプロットすると、細胞内に存在する収縮蛋白のCa^<2+>に対する感受性を知ることが出来る(Ca-L trajectory)。このCa-L trajectoryは、α受容体刺激薬(phenylephrine)によって容量依存性にグラフ上で左にシフトし、これは収縮蛋白系のCa^<2+>感受性増強を意味する。PKC阻害によりα受容体刺激による細胞内Ca-短縮関係のシフトは完全に抑制された。細胞内pHの変化もPKC阻害により抑制された。またこの系を用いて、c-AMP依存性反応についても検討した。Β受容体刺激及びPDE阻害薬により、Ca-L trajectoryは右にシフトした。またその時の細胞内c-AMP濃度はシフトの程度が同じにもかかわらず、PDE阻害薬のほうがβ受容体刺激に比し上昇していた。これらより本実験系を用いた、定常状態での細胞内Ca測定と細胞長変化の同時測定が確立され、生理活性物質である、カテコラミンの反応も確認できた。Α受容体刺激によるCa-L trajectoryのシフトはPKCを介した、細胞内アルカリ化によって起こることが確認された。一方、β受容体刺激はCa感受性を低下させることが確認され、c-AMPの上昇からPKAを介した反応であることが確認された。しかし、同様にc-AMPの上昇を起こすPDE阻害薬との比較検討を行ったところ、Ca-L trajectoryのシフトの程度は同じであったが、細胞内c-AMP濃度はPDE阻害においてより増大していた。つまり、細胞内収縮蛋白系におけるCa感受性の低下はβ受容体刺激のほうが、PDE阻害よりも効率よく効果を発現することがわかった。これらの結果を踏まえた上で、肥大心筋での機能評価を行うべく、肥大心筋モデルの作成に取り掛かった。麻酔下、人工呼吸管理下で大動脈を狭窄し圧負荷モデルを作成しつつある。今後この心臓より取り出した細胞から生理活性物質である、カテコラミンα及びβ受容体刺激の収縮蛋白系Ca反応性に対する反応を調べ、正常心筋と比較検討していく予定である。