分裂酵母を用いた哺乳動物細胞周期チェックポイントの再構築

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哺乳動物細胞における細胞周期チェックポイント機構を分裂酵母において再構築するために、分裂酵母におけるDNA複製チェックポイント機構の詳細を解析した。DNA複製チェックポイントはDNA複製が未完了の場合、細胞分裂期への移行を阻害することで染色体を安定に維持する機構であるが、どのような染色体構造を認識しているのかについては全く不明である。我々はOrp1およびCdc18変異体を用いてS期におけるDNA複製チェックポイントおよびDNA傷害チェックポイントを解析した。Orp1pとCdc18pはそれぞれDNA複製阻害時におけるCds1の活性化と維持に必須なタンパク質であることが明らかとなった。このことはDNA複製フォーク構造がCds1活性化に重要な役割を果たしていることを意味していると考えられた。一方、Orp1pとCdc18pのいずれもS期におけるDNA傷害チェックポイントにはほとんど関与していなかった。従って、S期におけるチェックポイント機構においてDNA複製をモニターする機構と、DNA傷害を完治する機構で全く異なっていることが示唆された。これらの知見を踏まえて、まず始めに分裂酵母Cdc2をヒト型Cdc2に置き換えた分裂酵母を作製した。この酵母は野生型に比較して増殖速度が遅く、DNA傷害あるいは複製阻害に対して明らかに感受性が高いため、チェックポイント解析には適さないと判断した。この理由としてCdc2活性を制御する因子群との相互作用が弱いのではないかと考え、現在サイクリンB,Cdc25等をヒト型に置き換えた変異体を作成中である。