活性型ARFの定量法および細胞内局在決定法の開発

低分子量GTP結合蛋白質ARFは,オルガネラ間の蛋白質輸送を行う輸送小胞の形成を調節する。細胞質に不活性なGDP結合型で存在するARFは,グアニンヌクレオチド交換因子(ARF-GEF)により活性を有するGTP型になるとオルガネラ膜に結合する。その部位にCOPIやAP-1などのコート蛋白質複合体が結合して輸送小胞の形成が始まる。次に,形成された輸送小胞上のGTP型ARFにGTPase活性化蛋白質(ARF-GAP)が作用してGTPがGDPへと加水分解され,ARFとともにコート蛋白質が小胞膜から遊離する。この裸の輸送小胞が標的オルガネラ膜に融合し,蛋白質輸送が完了する。つまり,細胞内小胞輸送はARF-GEFによるARFのGTP型への変換とARF-GAPによるGDP型への変換により調節されている。最近,ARFと結合して小胞輸送を調節する蛋白質GGAを同定し,GGA分子の中央にあるGATドメインがGTP結合型ARFとの特異的な結合に関与することを示した。そこで本研究では,このGATドメインとARFの結合機構について調べた。1.GGA1のGATドメインとGTP結合型のARFとの相互作用について,GATドメインの種々の変異体を作製し,相互作用の詳細を明らかにした。また,GATドメインのX線結晶構造解析を行い,その立体構造を明らかにした。2.この研究の過程で、GATドメインがユビキチンと結合することを発見した。さらに、ARFはGATのN末端側のサブドメインに、ユビキチンはC末端側のサブドメインに結合することを明らかにした。

低分子量GTP結合蛋白質ARFは,オルガネラ間の蛋白質輸送を行う輸送小胞の形成を調節する。細胞質に不活性なGDP結合型で存在するARFは,グアニンヌクレオチド交換因子(ARF-GEF)により活性を有するGTP型になるとオルガネラ膜に結合する。その部位にCOPIやAP-1などのコート蛋白質複合体が結合して輸送小胞の形成が始まる。次に,形成された輸送小胞上のGTP型ARFにGTPase活性化蛋白質(ARF-GAP)が作用してGTPがGDPへと加水分解され,ARFとともにコート蛋白質が小胞膜から遊離する。この裸の輸送小胞が標的オルガネラ膜に融合し,蛋白質輸送が完了する。つまり,細胞内小胞輸送はARF-GEFによるARFのGTP型への変換とARF-GAPによるGDP型への変換により調節されている。最近,ARFと結合して小胞輸送を調節する蛋白質GGAを同定し,GGA分子の中央にあるGATドメインがGTP結合型ARFとの特異的な結合に関与することを示した。そこで本研究では,このGATドメインとARFの結合機構について調べた。1.GGA1のGATドメインとGTP結合型のARFとの相互作用について,GATドメインの種々の変異体を作製し,相互作用の詳細を明らかにした。また,GATドメインのX線結晶構造解析を行い,その立体構造を明らかにした。2.この研究の過程で、GATドメインがユビキチンと結合することを発見した。さらに、ARFはGATのN末端側のサブドメインに、ユビキチンはC末端側のサブドメインに結合することを明らかにした。