活性型ARFの定量法および細胞内局在決定法の開発

开发量化活性 ARF 和确定细胞内定位的方法

• 批准号: 15657046
• 负责人: 中山 和久
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2003
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2003 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15657046/
• 关键词: GGA; ARF; X線結晶構造解析; 小胞輸送; ARF-GEF; アダプター; GATドメイン; ユビキチン

低分子量GTP結合蛋白質ARFは,オルガネラ間の蛋白質輸送を行う輸送小胞の形成を調節する。細胞質に不活性なGDP結合型で存在するARFは,グアニンヌクレオチド交換因子(ARF-GEF)により活性を有するGTP型になるとオルガネラ膜に結合する。その部位にCOPIやAP-1などのコート蛋白質複合体が結合して輸送小胞の形成が始まる。次に,形成された輸送小胞上のGTP型ARFにGTPase活性化蛋白質(ARF-GAP)が作用してGTPがGDPへと加水分解され,ARFとともにコート蛋白質が小胞膜から遊離する。この裸の輸送小胞が標的オルガネラ膜に融合し,蛋白質輸送が完了する。つまり,細胞内小胞輸送はARF-GEFによるARFのGTP型への変換とARF-GAPによるGDP型への変換により調節されている。最近,ARFと結合して小胞輸送を調節する蛋白質GGAを同定し,GGA分子の中央にあるGATドメインがGTP結合型ARFとの特異的な結合に関与することを示した。そこで本研究では,このGATドメインとARFの結合機構について調べた。1.GGA1のGATドメインとGTP結合型のARFとの相互作用について,GATドメインの種々の変異体を作製し,相互作用の詳細を明らかにした。また,GATドメインのX線結晶構造解析を行い,その立体構造を明らかにした。2.この研究の過程で、GATドメインがユビキチンと結合することを発見した。さらに、ARFはGATのN末端側のサブドメインに、ユビキチンはC末端側のサブドメインに結合することを明らかにした。

ARF, a low molecular weight GTP-binding protein, regulates protein transport and transport vesicle formation during protein production. Cytoplasmic inactive GDP-binding forms exist in ARF, which is a GTP-binding form of ARF-GEF. COPI and AP-1 protein complexes bind to each other and transport vesicles form. Secondly, GTP-activated protein (ARF-GAP), which forms GTP-type ARF on transport vesicles, plays an important role in the hydrolysis of GTP and ARF. The protein transport is completed by fusion of the membrane with the target naked transport cell. The intracellular transport is regulated by ARF-GEF, GTP and ARF-GAP. Recently, ARF binding and cellular transport are regulated by protein GGA, and GGA molecules in the center of the molecule are specifically associated with GTP-bound ARF binding. This study is based on the GAT model and ARF model. 1. GGA1 and GAT-binding ARF interaction, GAT-binding species and control, interaction details are described. The X-ray crystallographic analysis of GAT was carried out, and the three-dimensional structure of GAT was clarified. 2. The process of this research, GAT and GAT are the most important aspects of the research. The ARF is the first to combine the GAT's N terminal side and C terminal side.

项目成果

Shakoori, A. et al.: "Identification of a five-pass transmembrane protein family localizing in the Golgi apparatus and the ER"Biochem.Biophys.Res.Commun.. 312. 850-857 (2003)

Shakoori, A. 等人：“定位于高尔基体和内质网的五次跨膜蛋白家族的鉴定”Biochem.Biophys.Res.Commun.. 312. 850-857 (2003)

Shiba, Y., et al.: "GAT (GGA and Toml) domain responsible for ubiquitin binding and ubiquitination"J.Biol.Chem.. 279. 7105-7111 (2004)

Shiba, Y., et al.：“负责泛素结合和泛素化的 GAT（GGA 和 Toml）结构域”J.Biol.Chem.. 279. 7105-7111 (2004)

Matsukawa, J., et al.: "Role of ADP-ribosylation factor 6(ARF6) in gastric acid secretion"J.Biol.Chem.. 278. 36470-36475 (2003)

Matsukawa, J., et al.:“ADP-核糖基化因子 6 (ARF6) 在胃酸分泌中的作用”J.Biol.Chem.. 278. 36470-36475 (2003)

Shiba, T., et al.: "Molecular mechanism of membrane recruitment of GGA by ARF in lysosomal protein transport"Nat.Struct. Biol.. 10. 368-393 (2003)

Shiba, T. 等人：“溶酶体蛋白转运中 ARF 膜募集 GGA 的分子机制”Nat.Struct。